《Plant Biotechnology Journal》：Cross-Species Reprogramming of Developmental Plasticity and Metabolic Rewiring via Banana-Derived WUS2 Developmental Regulator
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本综述通过研究香蕉来源的发育调节因子GN-WUS2，揭示了其在促进植物再生、重塑代谢通路及提升作物产量方面的双重功能。研究表明，GN-WUS2不仅能在不依赖植物生长调节剂(PGRs)的条件下，显著提高烟草和香蕉的体细胞再生效率，还能通过上调HMGR1、IPPI2、SMT1-2等基因，增强异戊二烯和植物甾醇的生物合成。此外，GN-WUS2的表达促进了多种植物激素(如GA3、IAA、ABA)的积累，并引发了种子脂质谱的改变，包括新型脂质己二酸的合成。这些发现为利用发育调节因子GN-WUS2改良作物，特别是提高顽拗性作物的再生能力和代谢工程潜力提供了新策略。
1 引言
植物体细胞具备再生完整植株的非凡能力，这一过程受内在基因调控和植物激素信号的共同控制。在香蕉体细胞胚胎发生(SE)的关键阶段，WUS2基因的表达显著上调，这提示了其可能作为关键发育调节因子(DR)发挥作用。本研究旨在对香蕉品种Grand Naine来源的GN-WUS2进行功能鉴定，探究其通过组成型和诱导型表达系统，在烟草和香蕉中调控再生和代谢的能力。
2 结果
2.1 GN-WUS2表达增强烟草的芽再生能力
为了评估GN-WUS2促进再生的能力，研究构建了由CaMV35S启动子驱动的组成型表达载体(MWS)，并用于转化烟草叶片外植体。在不含植物生长调节剂(PGRs)的MS基本培养基上，表达GN-WUS2的外植体在培养2周后开始形成绿色器官样结构，4周后形成大量抗性芽。qRT-PCR证实，再生植株中GN-WUS2的转录水平显著升高，其中一个株系(MWS L1)的转录水平比对照高出1712.37倍。然而，组成型表达也引起了多效性效应，产生了I型(正常)和II型(异常)两种表型的芽。
2.2 诱导型GN-WUS2表达减轻发育缺陷
为了克服组成型表达带来的多效性缺陷，研究设计了一个基于糖皮质激素受体(GR)的诱导型表达系统(MWSI)。该系统通过地塞米松(DEX)诱导，实现了GN-WUS2表达的时空控制。在0.5 μM DEX浓度下，烟草外植体主要产生健康的I型芽，且GN-WUS2的表达量达到峰值(1050.56倍)。与组成型株系相比，诱导型株系表现出更低的GN-WUS2转录水平和更少的形态缺陷，证明了诱导型系统在避免多效性效应方面的效用。
2.3 诱导型GN-WUS2系统在香蕉转化体再生中的应用
基于在烟草中的成功，诱导型MWSI系统被应用于香蕉品种Grand Naine的胚性细胞悬浮(ECS)培养。在含有0.25 μM和0.5 μM DEX的MS基本培养基上，香蕉ECS成功再生出健康植株。在0.5 μM DEX处理下，再生香蕉芽中GN-WUS2的表达量相比非转化对照高出1000倍以上，证明了该系统在不同物种间的广泛适用性。
2.4 通过PCR确认转基因株系
PCR分析确认了hptII、GN-WUS2、nptII和pZmUbq等目的基因在烟草(MWS和MWSI)和香蕉(MI)转基因株系中的存在。
2.5 GN-WUS2诱导分化促进基因的表达
qRT-PCR分析显示，在MWS和MWSI烟草以及MI香蕉株系的幼叶中，关键的分化促进基因(DPGs)表达上调。在MWS烟草株系中，NtLEC2.2、NtLEC2.1和NtFUS3.1的诱导表达最为强烈。在诱导型株系中，LEC2和FUS3同源基因的表达呈现DEX依赖性模式。在香蕉MI株系中，MaFUS3.2、MaABI3.1和MaLEC2在0.5 μM DEX下也表现出高表达。这些基因的表达模式与各株系的芽再生结果相关。
2.6 GN-WUS2调控激素生物合成基因的表达
为了阐明激素的作用，研究分析了MWS、MWSI和MI株系幼叶中赤霉素(GA)、生长素和细胞分裂素生物合成基因的表达。在MWS烟草株系中，NtGA3和NtYUCCA8高度上调。在MWSI烟草株系中，这些基因的表达随DEX浓度增加而升高，在0.5 μM时达到峰值。在香蕉MI株系中，0.5 μM DEX诱导了MaGA20、MaYUCCA6和MaIPT的上调。这些结果表明GN-WUS2驱动了激素生物合成基因的激活及随后的再生反应。
2.7 GN-WUS2改变叶片解剖结构并促进生长
组织学分析表明，组成型表达GN-WUS2的MWS株系叶片明显增厚，这归因于栅栏细胞层增加、维管束密度增高以及细胞间隙减少。转基因叶片的厚度增加，MWS Line 1的叶片宽度为1847 μm，MWS Line 2为966 μm，而对照仅为635 μm。共聚焦显微镜观察证实，MWS株系的维管和叶肉组织以及根中均有强烈的GFP荧光，表明GN-WUS2融合蛋白的组成型表达。MWS株系(I型)还表现出更多的侧根形成，与对照植物相比，株高增加了约50%，且成熟更早。
2.8 GN-WUS2促进毛状体密度
扫描电子显微镜(SEM)分析显示，MWS株系的毛状体密度增加，形态发生改变。对照植物的毛状体分布稀疏(平均间距193.2 μm)，而MWS Line 1的毛状体排列更密集(间距176.2 μm)。与此观察结果一致，关键的毛状体调节因子NtGL1和NtGL2在三个MWS株系中的表达量均显著高于对照植物。在MWS Line 1中，NtGL1和NtGL2的表达上调最高，分别为87.05倍和6.57倍。一个预测的分子机制强调了GN-WUS2在协调烟草毛状体发育中的作用，推测是通过赤霉素(GA3)的作用介导的，特别是上调了NtGL1和NtGL2基因。
2.9 GN-WUS2增加GA和ABA积累
基于液相色谱-串联质谱(LC–MS/MS)的定量激素测定显示，所有三个MWS株系叶片中的赤霉素(GA3)、生长素(IAA)、脱落酸(ABA)和玉米素(Z)水平均高于对照。在MWS株系中，玉米素(Z)的浓度增加最低，最高达36 ng/100 mg，而IAA、GA3和ABA的水平则显著升高，分别高达164 ng/100 mg、20,000 ng/100 mg和83,300 ng/100 mg。
2.10 GN-WUS2加速种子萌发并提高产量
MWS株系表现出比对照更快的种子萌发速度和更高的荚果产量。立体显微镜分析显示，MWS株系的种皮呈黄色，而对照的种皮颜色较深。MWS株系的种皮颜色变化表明其原花青素减少和脂质积累增加。对T3代的分析显示，在荚果重量和种子数量指标上，MWS株系(L1–L5)的种子产量比对照高30%–50%，这支持了GN-WUS2的农艺潜力。
2.11 GN-WUS2改变种子形态和元素组成
SEM分析表明，MWS株系的种子比对照种子更小、更圆。能量色散X射线(EDX)光谱分析用于测定MWS株系和对照植物种子中的碳、氮和氧元素。结果显示，与对照(2.3%–2.4%)相比，MWS株系种子中氮的重量百分比和原子百分比显著增加(9.9%–11%)，这表明氮代谢发生了改变，并可能在其脂质和萜类生物合成中发挥作用。
2.12 GN-WUS2改变种子脂质谱
在MWS烟草株系的T3代种子中，GN-WUS2增强了异戊二烯和植物甾醇生物合成基因NtHMGR1、NtIPPI2和NtSMT1的表达。其中，NtIPPI2的反应最强烈，上调达358.30倍，其次是NtHMGR1(5.44倍)。这些基因表达的变化表明GN-WUS2的活性与形态发生之外的代谢途径存在联系，这一点已通过气相色谱-质谱(GC–MS)分析得到进一步证实。
MWS种子的GC–MS分析显示，关键脂肪酸(如棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸和亚麻酸)的积累增加，同时脂质代谢物己二酸在MWS Line 1和Line 2中显著出现。MWS Line 1表现出琥珀酸水平升高与己二酸产量增加相关的模式，而MWS Line 2则显示琥珀酸水平较低但己二酸积累较高。这些观察结果总结在一个转基因植物中通过反馈调节合成己二酸的假设机制中。酮酰辅酶A合成酶(NtKA)和琥珀酰辅酶A合成酶(NtSA)基因的表达谱进一步验证了己二酸的存在。在MWS Line 1中，NtKA和NtSA的表达显著上调，分别增加了128.66倍和213.35倍。相比之下，MWS Line 2的NtKA增加了380.76倍，但NtSA仅增加了1.09倍。
为进一步研究脂质积累的差异，对MWS株系和对照植物进行了主成分分析(PCA)。结果显示，第一主成分(PC1)解释了总变异的24.20%，且呈强正相关，而第二主成分(PC2)解释了21.30%的变异，也呈正相关。此外，利用京都基因与基因组百科全书(KEGG)数据库进行的通路富集分析表明，与对照相比，MWS line 1中不饱和脂肪酸生物合成通路的富集程度提高了四倍。
2.13 蛋白质组学数据分析
原始LC–MS/MS数据使用Proteome Discoverer进行处理，以进行蛋白质鉴定和定量。生成的数据用于下游热图和聚类分析。热图突出了差异表达蛋白(DEPs)，例如酰基辅酶A硫酯酶13样蛋白、糖基转移酶、Pinin样蛋白和花同源蛋白AGAMOUS样蛋白，这些蛋白在MWS Line 1种子中相对于对照富集，并与脂质积累和运输有关。蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络分析显示，在MWS Line 1种子中，DEP A0A1S3XUD3与其他脂质相关蛋白存在相互作用，而中心代谢酶丙酮酸激酶I在初级代谢网络中显示出相互作用。对照和MWS Line 1种子中DEPs的全局PPI分析揭示了它们与中心代谢和转录组通路的整合。这些蛋白质组学见解进一步支持了转基因株系种子中己二酸的生物合成。
3 讨论
本研究结果表明，GN-WUS2的异位表达足以在分化组织中诱导从头器官发生，并能在不添加激素的MS基本培养基上显著提高烟草和香蕉的再生效率。在CaMV35S启动子驱动下的DRs组成型表达有效促进了芽的形成，但也导致了多效性表型，这与早期在苹果和辣椒中的报道一致。为减轻这些效应，研究采用了DEX诱导型系统，从而实现了对GN-WUS2表达的时空控制。正如预期，DEX介导的激活触发了GR-DEX复合物的核转位，实现了精确的转录调控。最佳DEX浓度(0.5 μM)诱导了GN-WUS2的表达峰值，超过此浓度则表型异常再次出现。该诱导型系统能够在没有外源PGRs的情况下实现高效再生，并最大程度地减少了发育缺陷。
在烟草和香蕉中，GN-WUS2的表达都导致了关键DRs的转录重编程。LAFL-B3家族成员(LEC1、LEC2、FUS3和ABI3)在转化株系中差异表达。在烟草中观察到的调控反应在很大程度上在香蕉中是保守的。表达GN-WUS2的转基因香蕉株系(MI)表现出MaLEC2、MaFUS3、MaABI3、MaYUCCA6、MaGA20和MaIPT的转录水平增强，从而促进了ECS在不含激素的MS培养基上的再生。这些结果突显了诱导型表达系统在微调DRs活性和实现跨物种高效再生方面的价值。
植物激素谱分析表明，GN-WUS2的表达激活了赤霉素、生长素和细胞分裂素的生物合成途径。在烟草MWS株系中，NtGA3和NtGA20表达上调，分别达到2015.84倍和20倍，而MWSI株系表现出中等程度的诱导。升高的NtGA3和NtGA20表达与GA3积累增加、株高增加和毛状体密度增加相关，并且与B型细胞周期蛋白NtCYCB2的减少有关。生长素生物合成基因NtYUCCA6和NtYUCCA8也被强烈诱导。细胞分裂素的生物合成同样被激活，在MWS和MWSI烟草株系中，NtIPT的表达增加。组织学、SEM、共聚焦成像和EDX分析等多模态表型分析证实了上述表型观察结果，并揭示了转基因植物与对照植物之间显著的解剖学差异。定量LC–MS/MS分析进一步证实了有前景的MWS株系叶片中植物激素水平的升高。这些分析观察结果与植物株型、营养生长、种子产量和脂质积累的增强相关，这与之前在芍药和油茶中的发现一致。GC–MS分析揭示了不饱和脂肪酸的积累，表明GN-WUS2在代谢调控中具有更广泛的作用。
除了形态发生，GN-WUS2的表达还调控了与异戊二烯和植物甾醇生物合成相关的基因。甲羟戊酸途径中的关键基因NtHMGR1上调了5.44倍，这与其在甾醇生物合成和发育调控中的看家功能一致。相比之下，NtHMGR2基本保持不变，与其应激反应特性一致。在MWS株系中，胞质NtIPPI2上调了358.30倍，而质体定位的NtIPPI1则保持较低水平，强化了其在异戊二烯生物合成中的作用。涉及环阿屯醇甲基化的NtSMT1-2是植物甾醇生物合成中的关键步骤，表现出适度的上调，而NtCYP85A1、NtSQS和NtSMT2-2的表达保持不变，这表明GN-WUS2介导的通路具有特异性。与这些转录变化一致，MWS种子的GC–MS分析显示不饱和脂肪酸水平升高，并出现了新型脂质代谢物，如己二酸。这些代谢变化也与NtLEC2.1和NtLEC2.2的表达升高相关。蛋白质组学以及NtKA和NtSA基因的表达谱分析支持了转基因株系中存在己二酸。
据我们所知，这是首次将GN-WUS2鉴定为一种双重功能的DRs，它不仅促进不依赖激素的再生，还能重编程包括植物甾醇和脂质生物合成在内的代谢网络。本研究结果揭示了一个先前未被充分认识的WUS介导的调控维度，并将GN-WUS2确立为一种多功能候选因子，可用于推进各种作物植物的再生、转化和性状改良。尽管GN-WUS2活性在烟草中的功能保守性支持了其跨物种的实用性，但这项工作的主要意义在于其对香蕉改良的转化潜力。在香蕉中，胚性愈伤组织诱导和随后的转化效率仍然是主要瓶颈，因为转化体的回收率低，使得整个过程耗时且低效。值得注意的是，DEX诱导激活香蕉ECS中的GN-WUS2，在不添加外源植物激素的情况下，0.5 μM DEX浓度显著增强了芽的再生。该策略为常规转化体再生提供了一种实用的替代方案，后者依赖于基因型特异性的细胞分裂素-生长素比例的优化，而这个过程对于优良和顽拗性品种通常效果不佳。通过简化培养条件下的再生，GN-WUS2诱导具有减少转化时间和成本、促进转基因和基于基因组编辑的性状更高效部署的潜力。
尽管这些发现表明GN-WUS2可能协调发育调控与更广泛的代谢过程，但需要进一步的研究来确定这些效应是代表WUS蛋白的保守功能，还是香蕉同源基因的物种特异性属性。尽管如此，这些结果突出了GN-WUS2的多功能潜力，并支持其作为一种有价值的转化工具，用于提高再生效率和转化方案，特别是在顽拗性作物物种中。
