利用DszC酶对聚苯硫醚（PPS）二聚体模型中硫氧化过程的生物催化机制进行研究

基于DszC酶的PPS氧化催化机制研究：通过分子动力学和混合量子-分子动力学计算，揭示了DPS在酶活性口袋中的构象偏好性及氢键网络对能垒降低的作用，证实His391和Tyr96的协同氢键网络及水分子介导可有效降低氧化反应能垒，为PPS生物降解提供理论依据。

　　

作者：Pei Wang、Changru Ma、Anthony Bocahut、Sophie Sacquin-Mora、Carine Michel、Natacha Gillet

所属机构：法国国家科学研究中心（CNRS）、里昂高等师范学院（ENS de Lyon）化学实验室（UMR 5182），地址：46 Allée d’Italie, F-69342 Lyon, France

摘要

聚苯硫醚（PPS）是一种含有硫元素的聚合物，广泛应用于高性能材料领域。由于其稳定性，PPS的回收变得十分困难。本文报道了一项计算研究，探讨了DszC（一种来自4S途径的黄素依赖性单加氧酶）对二聚体PPS（DPS）氧化为亚砜衍生物（DPSO）的催化过程。分子动力学（MD）模拟显示，DPS在DszC的疏水腔内优先定位在黄素C^4a-氢过氧化物中间体附近。通过对涉及C^4a-氢过氧化物氢原子和氧原子的氢键网络进行分析，发现了五种不同的起始结构。这些结构包括分子内通过D-核糖醇尾部的稳定作用、与His391和Tyr96的分子间接触，以及两种水介导的稳定机制。自由能障碍分析表明，增强黄素C^4a-氢过氧化物附近氧原子的稳定性可以降低O-O键断裂的障碍。当His391和Tyr96残基都参与与反应物的氢键网络时，观察到了最低的障碍。此外，一个水分子也可以通过与远端氧原子的氢键作用来稳定过渡态，从而产生类似的障碍。这些发现表明，在接近生物脱硫条件（30°C）下，利用DszC蛋白对PPS进行酶促氧化是可行的，这为PPS聚合物的生物降解开辟了新的途径。

引言

聚苯硫醚（PPS）是一种高性能的工程热塑性塑料，以其卓越的热稳定性和化学抗性而闻名，广泛应用于航空航天、电子和汽车行业[1]、[2]、[3]、[4]、[5]。这一工业重要性得到了市场数据的印证：2024年全球PPS市场规模达到了13.0534亿美元，并预计从2024年到2031年将以8.3%的复合年增长率（CAGR）增长[6]、[7]。然而，日益增长的生产需求加剧了一个关键问题——尽管PPS具有优异的材料性能[6]、[7]，但其富含硫的骨架（占重量的30–35%）给热回收带来了重大挑战，因为PPS的热处理会释放致癌的硫氧化物，从而对健康和生态环境造成严重危害[8]、[9]。 一种可持续的解决方案可以借鉴碳骨架聚合物（如聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）的生物降解机制。实际上，针对酯键或脂肪链的PET生物降解途径已经得到了很好的研究，并且已经被工程化应用于工业[10]、[11]、[12]、[13]、[14]、[15]。微生物脱硫作为一种有前景的替代方法，可以在温和的反应条件下实现无害处理[16]、[17]、[18]。最近的研究表明，Pseudomonas细菌能够在较长的培养时间（30–60天）内部分降解PPS[19]、[20]。目前有三个基本的知识空白阻碍了这一领域的进展：（1）缺乏能够断裂聚合物C-S键的脱硫酶；（2）酶促脱硫过程的分子机制尚不明确；（3）对酶-大分子界面相互作用的理解有限。结合计算酶学和蛋白质工程的创新策略有助于克服这些障碍。 一个非常有趣的PPS脱硫模型是4S途径，Rhodococcus属细菌及其相关细菌利用这一途径降解二苯并噻吩（DBT）——这一过程在化石燃料的生物脱硫中至关重要[21]、[22]、[23]、[24]。在该途径中，Dsz酶系统的顺序和协同作用选择性地催化DBT中C–S键的氧化和断裂，生成2-羟基联苯和无机亚硫酸盐[21]、[22]、[23]、[24]、[25]、[26]、[27]、[28]、[29]、[30]、[31]。该过程首先由DszC催化DBT氧化为二苯并噻吩亚砜（DBTO），然后进一步氧化为DBTO₂。随后，DszA催化DBTO₂中的第一个碳-硫键断裂[25]、[26]、[27]。最后，DszB断裂最后一个C–S键，生成2-羟基联苯和亚硫酸盐[28]。此外，DszD通过NADH介导的氢转移促进黄素的还原，从而再生对DszC和DszA活性至关重要的还原型黄素辅因子[29]。这一成熟的机制框架可以为PPS的生物降解提供参考，因为这两种底物都含有中心芳香硫醚键。 在这里，我们使用计算模型研究了PPS的类似酶促降解过程。我们假设PPS首先经过DszC催化逐步氧化为PPSO，然后进一步氧化为PPSO₂，随后通过DszA/DszB的作用断裂C–S键，最终生成对羟基苯磺酸盐（HBS）和苯酚作为最终产物（图1b）。对DBT 4S途径的动力学分析确定，最初的DszC催化氧化和最终的DszB催化C–S键断裂是限速步骤[30]。我们将研究重点放在第一步——DszC催化的氧化上，因为这一步启动了整个催化级联反应，并为后续反应生成了必要的中间体，我们使用二苯硫醚（DPS）作为聚合物底物的模型。 由于DPS比DBT更具灵活性（DPS的两个苯环的邻位位置之间有一个额外的C–C键），因此对反应物在催化口袋内的构象空间进行采样至关重要。这将通过经典分子动力学（MM-MD）来实现，以高质量地采样底物在口袋内的可能取向，并确定口袋内是否存在水分子。此外，硫原子的亲核性可能与DBT不同。对应于硫原子氧化攻击的障碍将通过结合混合量子力学/分子力学（QM/MM）方法和 nudged elastic band 以及过渡态优化方法进行仔细研究。类似的方法已经成功用于研究DBT的氧化[25]。为了应对口袋构象变化如何影响催化位点活性的挑战[32]，我们将通过仔细分析经典分子动力学轨迹来选择多种起始构型。这种策略使我们能够在相对较低的计算成本下处理活性位点中的重要构象变化（如水分子的存在或残基旋转）。这样的事件所需的模拟时间尺度目前还无法通过QM/MM MD实现。我们的研究结合了DszC活性口袋中DPS的构象采样和QM/MM反应自由能评估，揭示了DszC活性位点如何适应催化DPS氧化的过程。

分子动力学模拟

DszC与FMN结合的结构来源于Rhodococcus erythropolis（PDB ID：3X0Y，分辨率为2.3 ?）[33]。选择了一个同源二聚体（链A和链F）来代表DszC酶模型。该模型包括了所有已解析的残基（链A中有402个，链F中有400个）和保守的水分子。可滴定残基的质子化状态根据Barbosa等人[25]描述的模型进行分配。具体来说，活性位点中的His92、His388和His391被质子化到N_δ位置。

DszC:DPS复合物的经典分子动力学

DszC被建模为其同源二聚体形式（图2）[25]、[33]，其中包含两个含有黄素单核苷酸（FMN）辅因子的催化口袋。为了氧化DBT或DPS，第一步是将这个FMN辅因子氧化为C^4aOOH中间体。这一步已经被认为是一个近乎无障碍的过程[25]、[49]、[50]。因此，我们选择了DszC的同源二聚体模型，其中：

(i)

一个活化位点含有氧化形式的辅因子，即C^4aOOH，其中O_p是近端氧原子

选择用于亚砜化的DPS反应构象

基于上述的动态特征和水合模式，我们试图确定DPS在DszC活性位点内的几种结合模式。为了避免任意选择，我们采用了一种逐步聚类的方法。首先，我们根据DBT氧化过程中发现的两个关键几何参数（S–O_d距离和S–O_d–O_p角度）来选择构象。

DPS氧化的催化机制

为了评估DszC催化的氧化过程的自由能障碍，我们采用了混合量子力学/分子力学（QM/MM）计算，并结合几何优化和NEB方法来优化路径和过渡态。由于活性位点的高灵活性，我们从400纳秒的长经典轨迹中选择了三个代表性构型（M1、M2、M3）进行采样。在QM区域中，我们还在两种情况下包含了水分子（M1-H₂O和M3-H₂O）。

结论

我们结合分子动力学（MD）模拟和量子力学/分子力学（QM/MM）计算，得出了DszC催化DPS亚砜化的催化机制。这一酶促反应首先涉及生物分子对C-S键的断裂，为PPS聚合物的生物降解提供了可能。通过对我们MD轨迹的筛选策略，我们识别出五种潜在的反应性构象，突出了活性位点的动态行为。

CRediT作者贡献声明

Pei Wang：撰写初稿、进行实验研究、进行形式分析。 Changru Ma：撰写、审稿和编辑、项目管理、概念构思。 Anthony Bocahut：撰写、审稿和编辑、提供监督。 Sophie Sacquin-Mora：撰写、审稿和编辑、提供监督。 Carine Michel：撰写、审稿和编辑、提供监督。 Natacha Gillet：撰写、审稿和编辑、提供监督、进行概念构思。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

SSM感谢法国政府的“Initiative d'Excellence”计划（项目“DYNAMO”，ANR-11-LABX-0011）的支持。PW衷心感谢K.C. Wong教育基金会和Syensqo的支持。我们还感谢里昂高等师范学院（ENS de Lyon）的CBPsmn（PSMN，数字建模科学中心）提供的计算资源。该平台运行了由Emmanuel Quemener开发的SIDUS解决方案（https://dl.acm.org/doi/abs/10.5555/2555789.2555792）。