《Journal of Chromatography A》：Alkaline Hydrolysis coupled with Array Gas Membrane Separation device and HPLC-FL for the determination of Metformin in complex samples
Jiaoqing Wei|Jiajia Wu|Xiaowen Hou|Rong Wang|Zhengyi Chen
广西药物发现与优化重点实验室，广西药物分子筛选与药效评价工程技术研究中心，桂林医学院药学院，中国桂林，541199
摘要
本研究开发了一种基于热辅助阵列气膜分离策略与高效液相色谱荧光检测相结合的方法，用于灵敏地测定二甲双胍。在碱性条件下加热时，二甲双胍原位转化为挥发性二甲胺（DMA），该物质通过疏水性PTFE膜选择性转移并捕获在酸性受体溶液中，随后用丹磺酰氯进行柱前衍生化以实现荧光检测。通过HILIC和高效飞行时间质谱对DMA的形成过程进行了机理研究，并鉴定出其他碱性降解产物（胍基脲类中间体、尿素和胍）。计算流体动力学模拟表明，在80°C热源下，膜上的流速集中（占总流速的57.6%），跨膜压力可忽略不计（<0.5 Pa），膜温适中（约49°C），这些因素解释了高效的转移效果和较低的二次挥发现象。优化了关键参数，包括加热时间、吸附配置和衍生化条件。在优化条件下，该方法在20-100 μg/mL范围内呈线性关系（R=0.9924），检测限为0.002 μg/mL（信噪比=3）。该方法在玉米丝茶和酸枣核茶中的应用表明，当添加量为100 μg/mL时，回收率为89.2-99.3%；在不同添加水平下，回收率在95.4–102.0%之间，且未出现明显的色谱干扰。碱性水解-阵列气膜分离-HPLC-FL方法集成了转化、膜分离和荧光衍生化技术，为复杂基质中二甲双胍掺假的常规筛查提供了一种高效且溶剂使用量少的方法。
引言
糖尿病是一种以持续高血糖为特征的慢性代谢疾病[[1], [2], [3]]，其全球患病率的增加构成了重大的公共卫生挑战[4,5]。二甲双胍是一种广泛用于2型糖尿病治疗的一线口服降糖药物[6,7]，具有显著的疗效和良好的安全性，因此得到了广泛应用。然而，随着健康补充剂行业的迅速扩张，不法制造商非法添加药物（尤其是二甲双胍和格列奈类降糖药）的现象日益严重。长期过量摄入含有这些药物的补充剂会对健康造成严重风险，包括乳酸酸中毒[8]、胃肠道紊乱[9]、维生素B12缺乏[10]、肝肾功能受损[11]以及低血糖[12]。因此，能够检测复杂基质中微量二甲双胍的可靠分析技术对于消费者安全和监管控制至关重要。
目前的分析方法主要依赖于先进的色谱技术，包括高效液相色谱（HPLC）[13]、气相色谱-串联质谱（GC-MS/MS）[14]、高效薄层色谱（HPTLC）[15]和液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）[16]。这些方法因其出色的灵敏度和选择性而受到青睐。同时，新兴的快速检测技术，如表面增强拉曼光谱（SERS）[17]、电化学传感器[18]和比色法[19]，在速度、便携性和简便性方面具有显著优势。然而，在分析健康补充剂中常见的复杂基质时，这些方法常常会受到严重的基质干扰，导致准确度降低和微量检测能力受限。
样品预处理技术在减轻基质干扰和提升分析性能方面起着关键作用。传统的固相萃取（SPE）[20]应用广泛，但存在操作繁琐、溶剂蒸发和浓缩步骤多以及处理时间长的问题。液-液萃取（LLE）[21]虽然相对简单，但由于二甲双胍的极性较高，需要使用离子对试剂或在强碱性条件下进行萃取。然而，LLE过程通常需要大量环境有害的有机溶剂。其他提取方法，如超声辅助萃取（UAE）[22]和超临界流体萃取（SFE）[23]，面临优化复杂、重复性差和后处理浓缩过程繁琐等挑战。基于分子印迹聚合物（MIPs）[24]、荧光传感器[25]和金属有机框架（MOFs）[26]的新型吸附剂和传感器虽然具有增强的富集能力，但由于合成要求复杂、依赖专用仪器以及需要大量劳动和时间，限制了其在快速现场分析中的实际应用。
一种有效的规避基质干扰的方法是将目标分析物转化为气态物质。通常，衍生化反应可以降低极性并提高挥发性，从而生成可检测的气态化合物。碱性分解是另一种有前景但尚未充分利用的方法。受经典凯氏定氮法的启发，该方法在碱性条件下能高效地将蛋白质分解为挥发性氨，我们的研究发现了碱性水解（AH）在二甲双胍检测中的潜力。具体而言，在碱性条件下，二甲双胍分解产生挥发性二甲胺（DMA）气体，这提供了独特的分析优势。
基于这一概念，李教授团队开发的紧凑型便携式气膜分离设备在从复杂基质中选择性分离挥发性分析物方面表现出优异的性能[[28], [29], [30]]。利用这些技术进步，本研究引入了一种新的分析方法，结合了碱性水解（AH）、阵列气膜分离（AGMS）设备和高效液相色谱荧光（HPLC-FL）检测。分析流程包括在设备孔中通过氢氧化钠促进样品的碱性热分解，释放出挥发性DMA。由于DMA本身不具有荧光团，直接荧光检测较为困难，因此采用丹磺酰氯（5-二甲氨基萘-1-磺酰氯，DNS-Cl）进行衍生化，生成可通过HPLC-FL进行灵敏定量检测的荧光衍生物。这种创新方法通过有效的气相分离显著减少了基质干扰，从而实现了对二甲双胍的准确、快速和灵敏的检测。该方法通过检测健康补充剂中的非法添加物得到了成功验证，证明了其实际应用性和可靠性。
试剂和材料
二甲双胍盐酸盐（纯度99%），购自中国上海TCI化工发展有限公司。乙胺（在H2O中的含量为68-72wt%），购自中国上海Anaiji制药化工有限公司。二甲胺盐酸盐（纯度99%）、磷酸（色谱级，纯度85-90%）和丹磺酰氯（纯度≥98%），购自中国上海Aladdin化学有限公司。十水合四硼酸钠（纯度≥99.5%），购自xilong scientific。
基于热辅助AGMS工作流的二甲双胍检测策略
建立了基于热辅助AGMS的二甲双胍检测策略（图1）。核心创新在于间接定量原理：二甲双胍在碱性条件下加热原位转化为挥发性DMA，该物质通过疏水性膜选择性转移至受体溶液中，从而在一个设备中实现了反应、分离和基质简化的集成。先前的机理研究表明，二甲双胍可以生成胺类碎片（包括DMA）
结论
本研究建立了一种高通量且灵敏的AH-AGMS-HPLC-FL方法，用于快速筛查和定量检测抗糖尿病健康产品中非法添加的二甲双胍。通过系统优化AGMS设备的气膜分离条件及下游DNS-Cl衍生化参数，该联用流程在受控条件下运行，表现出良好的线性关系、低检测限和可接受的回收率。
作者贡献声明
Jiaoqing Wei：撰写初稿、数据管理。Jiajia Wu：数据管理。Xiaowen Hou：数据可视化、验证。Rong Wang：撰写、审稿与编辑、数据可视化、验证、项目管理。Zhengyi Chen：撰写、审稿与编辑、项目管理、方法学研究、资金获取、概念构思。
利益冲突声明
作者声明没有已知的可能会影响本文研究的财务利益或个人关系。
致谢
本工作得到了国家自然科学基金（编号：22464010）和广西自然科学基金（编号：2025GXNSFAA069294、2023GXNSFBA026167）的支持。此外，还得到了2025年百桂青年拔尖人才项目的资助。
