《Advanced Science》：Programmable Semi-Interpenetrating Living Materials With Robust Stability for Versatile Bioremediation and Biotherapeutics
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本文报道了一种基于温度敏感性羟丁基壳聚糖（HBC）和细菌介导的Spy蛋白质原位自组装的可编程半互穿结构活性材料（sIHSELM）。该材料制备方法简便，摒弃了苛刻化学交联剂，具有优异的机械性能和环境稳定性。通过调控封装细菌负载，实现了半互穿网络对材料性能的增强。研究验证了其在两大领域的应用：1）在炎症性肠病治疗中，该材料有效保护表达白介素-2（IL-2）的益生菌，通过调节肠道免疫和微生物群发挥显著疗效；2）在环境修复中，其承载的有机磷水解酶（OPH）在极端pH、温度和盐度下仍能长期维持活性，实现对污染物对氧磷（PAR）的高效降解。此工作为构建功能可定制、稳定且安全的工程活性材料提供了通用平台。
引言：工程活性材料的新机遇与挑战
工程活性材料（ELMs）将活性生物组分整合到材料基质中，旨在开发“智能”、动态的功能材料，广泛应用于建筑材料、可穿戴设备、生物传感、生物修复和生物治疗等领域。然而，其实用化面临制造工艺复杂、长期稳定性不足等关键挑战。为此，本研究开发了一种新型的可编程半互穿结构活性材料，旨在通过一种简便、温和的制备策略，构建兼具优异稳定性、机械强度和功能可定制性的新型ELM平台。
sIHSELM的设计与构建
该材料体系的核心是温度敏感性聚合物——羟丁基壳聚糖（HBC）。HBC具有良好的生物相容性和水温敏感凝胶化特性，在低于其低临界溶解温度（LCST）时呈液态，高于LCST时快速（约15秒）形成物理交联的水凝胶，无需任何化学交联剂。然而，纯HBC水凝胶的稳定性，尤其在酸性条件下，较为有限。为解决此问题，研究者引入了由活细菌介导形成的半互穿网络。
研究团队设计了工程化细菌，使其表达可自发形成共价键的SpyTag和SpyCatcher嵌合蛋白。这些细菌被预先封装在HBC溶液中。通过温度诱导（或阿拉伯糖诱导）启动细菌内裂解蛋白（E蛋白）的表达，导致细菌裂解，从而将细胞内表达的SpyTag和SpyCatcher蛋白释放到HBC网络中。这两种蛋白在胞外自发、高效地发生共价结合，形成聚合物网络，与物理交联的HBC网络相互穿插，构成了半互穿网络结构，即sIHSELM。该网络的形成显著增强了材料的力学性能和环境稳定性。通过精确调控封装细菌的数量（如sIHSELMC20+T30组），在细菌对网络结构的破坏效应与半互穿网络的稳定增强效应之间找到了最佳平衡，从而获得了最规整的微观结构、最高的压缩断裂应力（67.4 kPa）和储能模量。
卓越的稳定性与保护效应
sIHSELM表现出远超纯HBC水凝胶的卓越环境稳定性。在宽泛的pH环境（pH 2-12）、模拟胃液（SGF）和模拟肠液（SIF）中，sIHSELM在长达14天的测试期内结构保持完整，质量损失很小。相比之下，纯HBC在酸性条件下会溶胀并最终溶解。这种稳定性得益于半互穿网络的加固作用，使其能够为封装其中的细菌提供强有力的保护。实验表明，封装在sIHSELM中的大肠杆菌Nissle 1917（ECN）在SGF、SIF和胆汁盐中存活率显著高于游离细菌，并且在-80°C冷冻保存8天后仍能复苏，证实了其作为口服递送载体的巨大潜力。
在溃疡性结肠炎治疗中的应用
基于其优异的口服递送保护能力，研究者将sIHSELM应用于炎症性肠病（IBD）的治疗。他们封装了工程化的益生菌ECN，该菌株可分泌表达具有免疫调节功能的细胞因子白介素-2（IL-2），并与表达Spy蛋白的菌株共封装，形成具有治疗功能的sIHSELM。
在右旋葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的小鼠急性结肠炎模型中，口服给予负载IL-2表达菌的sIHSELM，展现了显著的治疗效果。与PBS对照组和游离ECN-IL-2组相比，sIHSELM治疗组小鼠的体重更快恢复，疾病活动指数（DAI）显著降低，结肠长度缩短得到明显改善。组织学分析显示，该组小鼠结肠上皮结构更完整，炎症细胞浸润减少。机制研究表明，sIHSELM能够：1）调节结肠局部促炎因子（TNF-α, IL-1β, IL-6）和抗炎因子（IL-10, TGF-β）的平衡；2）上调结肠紧密连接蛋白（ZO-1, Occludin）的表达，修复肠道屏障；3）促进调节性T细胞（Tregs, Foxp3+CD4+）增殖，抑制辅助性T细胞17（Th17, IL-17a+CD3+）和中性粒细胞（Ly6G+CD45+CD11b+）的炎症反应；4）重塑肠道菌群，增加有益菌如毛螺菌科和穆里巴库拉科的丰度，降低变形菌门等有害菌的比例。这些效应共同促成了结肠炎的缓解。此外，系统的生物安全性评估（血液学、血清生化、主要器官组织病理学）表明sIHSELM具有良好的生物相容性。
在环境污染物生物修复中的应用
为展示sIHSELM平台的可编程性和在环境领域的应用潜力，研究者将其功能模块切换为表达有机磷水解酶（OPH）。OPH能将剧毒有机磷农药对氧磷降解为刺激性较小的对硝基苯酚。
将表达SpyTag-OPH融合蛋白的工程菌封装入sIHSELM，成功构建了具有高效降解能力的材料。该sIHSELM可快速降解对氧磷。更重要的是，得益于sIHSELM基质的保护作用，其中封装的OPH酶在各种严苛环境下的活性保持时间远超游离酶。在高温（42°C）、酸性（pH 4-7）和高盐（30-50 g L-1NaCl）条件下储存多日，sIHSELM中的OPH活性保留率显著高于游离OPH。此外，sIHSELM还表现出良好的可重复使用性和可再生性，经过多次催化循环后，通过补充培养基使封装细菌恢复活性，可重新生成OPH，使材料活性几乎完全恢复。这为长期、稳定的环境污染现场修复提供了新策略。
讨论与结论
本研究成功开发了一种通用的sIHSELM平台，其创新性体现在：1）整合了HBC的温和、快速温敏凝胶化与细菌介导的蛋白质原位自组装，形成了动态增强的半互穿网络结构；2）材料具有前所未有的宽范围pH、温度、盐度稳定性，并能长期储存；3）制备过程简单、安全、可扩展，且可利用HBC的热响应性进行3D打印成型；4）平台高度模块化和可编程，通过更换封装菌株的功能基因，可灵活赋予材料治疗、修复、传感等多种功能。
通过分别集成IL-2和OPH功能模块，研究验证了sIHSELM在生物治疗（溃疡性结肠炎）和生物修复（有机磷农药降解）两个截然不同领域的卓越性能。该工作为构建下一代具有定制化功能、卓越环境适应性和生物安全性的工程活性材料奠定了坚实的基础，并为解决生物医学和环境工程中的复杂挑战提供了创新的材料平台。未来，通过优化基因回路稳定性、整合多功能级联基因以及进行表面改性以防止生物泄露，该平台的应用范围有望进一步拓展。
