《Advanced Science》：NIPAL1 Drives a Metabolic-Epigenetic Feedback Loop to Promote Lactate-Mediated Immune Evasion in Esophageal Cancer
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本研究发现，在食管鳞状细胞癌（ESCC）中，NIPAL1通过招募酪氨酸激酶HCK磷酸化LDHA的Y10位点，增强糖酵解和乳酸生成。累积的乳酸进而促进p300介导的组蛋白H3K18乳酰化（H3K18la），后者反过来转录激活NIPAL1的表达，形成一个自我维持的NIPAL1-HCK-p-LDHA-乳酸-p300-H3K18la反馈环路。该环路独立于NIPAL1经典的镁转运活性，通过损害CD8+T细胞功能促进免疫逃逸。靶向抑制HCK或p300可打破此环路，恢复抗肿瘤免疫，并增敏抗PD-1治疗。本研究揭示了一条整合肿瘤代谢与免疫调控的新型信号通路，为改善ESCC的免疫治疗疗效提供了有前景的靶点。
引言
食管鳞状细胞癌（ESCC）是一种高度侵袭性的恶性肿瘤，预后不佳。尽管免疫检查点阻断（ICB）疗法取得了进展，但临床反应仅限于部分患者，这主要归因于免疫逃逸和免疫抑制性肿瘤微环境（TME）。代谢重编程是癌症的标志之一，在肿瘤进展和免疫逃逸中扮演着关键角色。近年来，乳酸——有氧糖酵解（Warburg效应）的代谢副产物，被发现可作为表观遗传的关键非代谢调节剂。通过组蛋白赖氨酸乳酰化（Kla），尤其是在H3K18位点，乳酸可调节与癌症进展相关的转录程序。然而，在ESCC中，驱动乳酸积累并将代谢重编程与免疫逃逸联系起来的上述调节因子仍不明确。NIPA样蛋白1（NIPAL1）是一种膜蛋白，本研究中，我们揭示了NIPAL1在ESCC中作为连接代谢重编程与免疫逃逸的关键致癌驱动因子。
结果
NIPAL1在ESCC中上调并促进肿瘤细胞增殖
研究发现，与配对的癌旁组织相比，NIPAL1蛋白水平在ESCC组织中显著升高。免疫组化分析显示，NIPAL1高表达与晚期T和N分期相关，并预示着患者更差的总体生存（OS）结局。功能实验证实，敲低NIPAL1可显著抑制ESCC细胞在体外的增殖和集落形成能力，而过表达NIPAL1则促进增殖。在裸鼠皮下异种移植模型中，NIPAL1敲低显著减少了肿瘤生长和重量，而过表达则增强了肿瘤生长。这些发现表明NIPAL1在ESCC中高表达，并通过促进细胞增殖和致瘤潜能推动ESCC进展。
NIPAL1与LDHA相互作用并调节其活性
为了阐明NIPAL1促进ESCC增殖的机制，研究人员进行了免疫共沉淀（co-IP）结合液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析。京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析显示，与NIPAL1相互作用的蛋白在代谢通路，特别是糖酵解和糖异生中富集。其中，糖酵解关键酶乳酸脱氢酶A（LDHA）被鉴定为NIPAL1的相互作用蛋白，co-IP和免疫荧光（IF）实验证实了二者的相互作用及胞质共定位。
功能上，敲低NIPAL1降低了LDHA酶活性，而过表达则增强其活性。值得注意的是，改变NIPAL1表达不影响总LDHA蛋白水平，但可调节LDHA酪氨酸10位点（Y10）的磷酸化水平。已知LDHA Y10磷酸化可通过稳定其四聚体形成来增强酶活性。实验进一步证实，NIPAL1敲低降低了细胞内和细胞外乳酸水平，而过表达则增加了乳酸的产生和释放。通过回复实验，外源表达LDHA野生型（WT），而非Y10F突变体，可恢复NIPAL1敲低细胞的增殖效应，突出了LDHA Y10磷酸化在介导NIPAL1促增殖作用中的关键角色。
NIPAL1通过促进HCK-LDHA相互作用来调节LDHA
NIPAL1蛋白缺乏内在酪氨酸激酶活性。研究人员从蛋白质组学数据中筛选出Src家族激酶HCK作为NIPAL1的潜在相互作用伙伴。Co-IP实验证实了HCK、NIPAL1和LDHA三者之间存在相互作用。重要的是，过表达NIPAL1增加了与HCK共沉淀的LDHA量，邻近连接试验（PLA）也显示NIPAL1过表达显著增强了HCK与LDHA之间的相互作用。蔗糖梯度沉降分析进一步表明，NIPAL1敲低破坏了NIPAL1-HCK-LDHA复合物的形成。
分子对接模拟预测HCK和LDHA结合在NIPAL1的不同区域。通过构建NIPAL1截短突变体（Δ358–410和Δ89–114）进行验证，发现缺失358–410区段部分损害了NIPAL1与LDHA的相互作用，而缺失89–114区段则部分减弱了NIPAL1与HCK的相互作用。这支持了一个模型：HCK和LDHA均可直接结合NIPAL1，同时它们之间也存在相互作用，NIPAL1可能通过募集HCK至LDHA并诱导构象重排来促进它们的结合。
激酶活性实验显示，共表达HCK导致LDHA酪氨酸磷酸化大幅增加，而共转染NIPAL1进一步增强了这一过程。此外，NIPAL1过表达所增强的LDHA Y10磷酸化、酶活性、乳酸产生和细胞增殖，均可被HCK抑制剂A419259所废除。这些数据表明NIPAL1通过HCK依赖的机制促进LDHA活化和乳酸代谢。有趣的是，补充细胞外Mg2+并不影响NIPAL1介导的乳酸产生，表明NIPAL1的这一调节功能独立于其镁离子转运活性。
NIPAL1表达受肿瘤来源乳酸通过组蛋白乳酰化上调
研究进一步探索了NIPAL1高表达的机制。用乳酸处理ESCC细胞会导致NIPAL1蛋白和LDHA Y10磷酸化水平呈时间依赖性增加。相反，用糖酵解抑制剂2-脱氧葡萄糖（2-DG）或LDHA抑制剂GSK2837808A处理，则会降低NIPAL1表达和LDHA磷酸化。
由于组蛋白乳酰化可激活基因转录，研究人员评估了其在NIPAL1表达中的作用。乳酸处理提升了NIPAL1的mRNA和蛋白水平，以及全局赖氨酸乳酰化（pan-Kla）和H3K18la水平，而H3K9la和H4K12la水平未受影响。已知乙酰转移酶p300是组蛋白乳酰化的关键“书写器”。用p300抑制剂A485处理，降低了基础的pan-Kla、H3K18la和NIPAL1水平，并阻止了乳酸诱导的它们的上调。染色质免疫沉淀（ChIP）实验显示，乳酸处理后，H3K18la在NIPAL1启动子区显著富集，而A485处理可消除此富集。核连缀转录（NRO）实验也证实，乳酸增加了NIPAL1启动子的转录活性，而p300抑制逆转了此效应。
鉴于乳酸的产生由NIPAL1依赖的LDHA激活所放大，研究人员假设存在一个连接代谢重编程和组蛋白乳酰化的正反馈环路。实验证实，抑制HCK或p300均可降低NIPAL1表达、H3K18la水平和LDHA磷酸化，并削弱NIPAL1驱动的细胞增殖。值得注意的是，即使在NIPAL1过表达的情况下，HCK抑制剂A419259或p300抑制剂A485处理也能降低NIPAL1蛋白水平。这支持了一个自我维持的反馈环路：HCK介导的LDHA磷酸化促进乳酸积累，乳酸驱动p300依赖的H3K18la以维持NIPAL1转录。破坏HCK或p300则打破此环路。
NIPAL1-HCK-H3K18la环路调节ESCC糖酵解
鉴于LDHA在糖酵解中的核心作用，研究验证了NIPAL1对糖代谢的影响。与对照相比，过表达NIPAL1的细胞表现出葡萄糖摄取和乳酸释放的显著增加。通过Seahorse分析仪测量细胞外酸化率（ECAR）表明，NIPAL1过表达增强了ESCC细胞的糖酵解通量，而HCK抑制剂或p300抑制剂可废除此效应。这提示NIPAL1通过HCK-p-LDHA-乳酸-p300-H3K18la信号轴促进糖酵解。
临床相关性上，研究人员根据18F-FDG PET/CT最大标准化摄取值（SUVmax）将30名ESCC患者分为高代谢组和低代谢组。免疫组化分析显示，NIPAL1表达与LDHA Y10磷酸化和H3K18la水平呈正相关。此外，高代谢活性患者的肿瘤组织中NIPAL1、p-LDHA（Y10）和H3K18la水平显著高于低代谢组。统计分析显示NIPAL1、p-LDHA（Y10）、H3K18la与SUVmax值之间存在显著正相关。这些临床数据支持NIPAL1介导的葡萄糖代谢重编程有助于ESCC进展的模型。
NIPAL1通过增加乳酸分泌到肿瘤微环境来调节CD8+T细胞活性
亚细胞分级分离和免疫荧光染色显示，NIPAL1主要定位于线粒体、高尔基体和内质网等细胞器膜，而非质膜，表明它不直接介导乳酸跨质膜输出，而是通过转运体非依赖的机制调节乳酸代谢。
鉴于乳酸可抑制CD8+T细胞功能，研究探讨了NIPAL1介导的乳酸积累是否具有免疫调节作用。与过表达NIPAL1的ESCC细胞共培养，显著抑制了CD8+T细胞的增殖，并降低了其细胞因子（如TNF-α、IFN-γ、GZMB）的产生。流式细胞术还显示，NIPAL1过表达组中CD25+CD69+活化T细胞比例显著降低。在IFN-γ刺激下，NIPAL1过表达并不影响PD-L1水平，表明其免疫抑制不通过调节PD-L1实现。
在MC38小鼠皮下移植瘤模型中，流式分析显示，NIPAL1高表达肿瘤中浸润CD8+T细胞上衰竭标志物PD-1、TIM-3和TIGIT的表达显著增加，同时细胞因子产生性CD8+T细胞比例显著降低。
为确定CD8+T细胞抑制是否由可溶性因子介导，研究人员收集了对照或NIPAL1过表达肿瘤细胞的条件培养基（CM）用于培养CD8+T细胞。来自NIPAL1过表达细胞的CM显著抑制了CD8+T细胞增殖，而当肿瘤细胞用LDHA抑制剂、HCK抑制剂或p300抑制剂预处理时，这种抑制作用被废除。这些结果表明，NIPAL1诱导的CD8+T细胞功能抑制是由肿瘤来源的可溶性因子介导的，并依赖于HCK-乳酸-p300信号轴。
靶向NIPAL1-HCK-H3K18la环路使肿瘤对检查点治疗增敏
鉴于乳酸在维持T细胞耗竭中的关键作用，靶向乳酸代谢可能与免疫检查点抑制剂（ICIs）产生协同作用。在荷NIPAL1过表达MC38肿瘤的小鼠模型中，与单药或对照治疗相比，HCK抑制剂或p300抑制剂与抗PD-1抗体联合治疗显著抑制了肿瘤生长。
为评估临床相关性，研究人员检测了60名接受新辅助免疫治疗的ESCC患者治疗前活检标本中NIPAL1、p-LDHA（Y10）和H3K18la的表达水平。结果显示，对ICIs治疗反应不良的患者，其NIPAL1、p-LDHA（Y10）和H3K18la水平显著高于反应良好的患者。NIPAL1表达与p-LDHA（Y10）和H3K18la水平均呈正相关。这些数据表明NIPAL1-HCK-H3K18la信号轴驱动了ESCC对ICB的耐药性，靶向此正反馈环路可能增强耐药肿瘤的治疗效果。
讨论
本研究揭示了一条先前未被认识的、由NIPAL1驱动的代谢-表观遗传轴，它促进ESCC的肿瘤进展和免疫逃逸。其核心机制在于NIPAL1通过募集酪氨酸激酶HCK磷酸化LDHA Y10，增强糖酵解和乳酸生成。积累的乳酸进而促进p300介导的H3K18la，后者转录激活NIPAL1表达，从而形成一个自我维持的NIPAL1-HCK-p-LDHA-乳酸-p300-H3K18la反馈环路。这一表观遗传-代谢回路放大了致癌信号和肿瘤支持性表观遗传修饰。
关键机制在于发现了NIPAL1-HCK-p-LDHA信号轴通过酪氨酸磷酸化调节糖酵解。NIPAL1不改变LDHA表达，而是通过募集Src家族酪氨酸激酶HCK来增强其酶活性，该激酶磷酸化LDHA的Y10位点。尽管NIPAL1属于镁转运蛋白家族，但其在乳酸产生中的调节作用独立于离子转运活性。它主要定位于细胞器膜，调节HCK和LDHA的空间构象以增强其相互作用。
乳酸最近已成为通过组蛋白乳酰化这种新型翻译后修饰将细胞代谢与表观遗传调控联系起来的关键代谢中间体。本研究表明，NIPAL1不仅促进乳酸产生，还通过H3K18la促进表观遗传重塑，从而建立了一个自我维持的代谢-表观遗传环路。
除促进表观遗传重塑外，乳酸在TME内还具有深远的免疫抑制效应。本研究数据表明，NIPAL1驱动的乳酸代谢通过肿瘤来源的可溶性介质抑制CD8+T细胞功能，这主要依赖于HCK-乳酸-p300信号轴，将代谢重编程与TME中的免疫功能障碍联系起来。
这些发现支持存在一个NIPAL1-HCK-H3K18la免疫调节轴，它整合了代谢重编程和表观遗传修饰以驱动免疫抑制。该轴不仅加剧了肿瘤侵袭性，还破坏了免疫监视，导致了对ICIs的耐药。临床上，NIPAL1、p-LDHA和H3K18la的表达水平与对ICB的反应呈正相关，表明它们有潜力作为预测生物标志物，用于筛选适合联合治疗的患者。
结论
本研究揭示了ESCC中先前未表征的、由NIPAL1驱动的代谢-表观遗传-免疫交互作用。我们确定了NIPAL1-HCK-p-LDHA-乳酸-p300-H3K18la级联反应是一个自我强化的信号环路，可促进肿瘤生长和免疫逃逸。靶向该轴不仅可以重编程肿瘤代谢，还能恢复CD8+T细胞功能并使肿瘤对ICB增敏。这些发现为在ESCC中靶向代谢-表观遗传通路，特别是NIPAL1驱动的信号级联，以增强对免疫治疗的反应性和改善患者预后，提供了强有力的理论依据。
