《Advanced Science》：Adhesion-Related Macrophages Regulate Metabolic Homeostasis Through CAV-1 Dependency
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本研究揭示了一类先前被忽视的脂肪组织巨噬细胞（ATM）亚群——黏附相关巨噬细胞（ARM）。该研究通过新方法成功分离ARM，并发现其在肥胖过程中显著扩增，成为ATM的主要成分。ARM通过直接黏附于脂肪细胞并摄取其mRNA，从而增强自身的脂质处理能力，对维持代谢稳态至关重要。研究还确定Caveolin-1（CAV-1）是ARM的关键功能标志物，其缺失会破坏ARM功能，导致脂肪组织功能障碍和葡萄糖稳态失衡。该发现为肥胖相关代谢性疾病提供了新的治疗靶点。
引言
肥胖已成为全球性的重大公共卫生问题，超过半数人口面临超重或肥胖的困扰，并显著增加罹患2型糖尿病、脂肪肝、高血压、心血管疾病及多种癌症的风险。肥胖诱导的脂肪组织炎症已被证实是连接肥胖与其并发症的关键媒介。在脂肪组织中，巨噬细胞作为最主要的免疫细胞群，是促进脂肪组织炎症的核心角色。随着对巨噬细胞异质性认知的深入，其非免疫功能日益凸显，例如促纤维化（LY6A+巨噬细胞）、刺激血管生成（血管相关巨噬细胞，VAMs）、调节交感神经系统（交感神经元相关巨噬细胞，SAMs）以及调控脂质代谢（脂质相关巨噬细胞，LAMs和代谢激活巨噬细胞，MMe巨噬细胞）。LAMs在肥胖期间积累，能够缓冲过量脂质诱导的脂毒性，以维持系统稳态。
标准的脂肪组织巨噬细胞（ATM）分离流程已广泛建立，通常通过胶原酶消化脂肪组织，离心后获得位于上层的脂肪细胞和沉降于底部的基质血管组分（SVF）。ATM则从SVF中通过磁珠或流式细胞术（FCM）分选获得。胶原酶是脂肪组织消化的主要酶，因其细胞得率高且能保护细胞表面蛋白而被广泛使用。在确保充分消化的前提下，研究人员在分离小鼠和人类脂肪细胞时，均观察到脂肪细胞层中存在巨噬细胞污染物。为了去除巨噬细胞污染以获得纯化的脂肪细胞，采用了抗CD45磁珠孵育粗分离的脂肪细胞。结果发现，脂肪细胞层中的巨噬细胞黏附于单个脂肪细胞，这类细胞被命名为黏附相关巨噬细胞（ARMs）。它们与脂肪细胞紧密互作，可能在维持脂肪组织稳态中扮演关键角色，但在过往的ATM研究中被长期忽视。
结果
2.1 肥胖诱导ARMs积累
目前对ARM所知甚少，主要受限于可靠的分离方法。为研究此巨噬细胞亚群，本研究开发了ARM的分离方法。脂肪组织样本经PBS剪碎，胶原酶消化后离心分离出上浮的脂肪细胞和SVF沉淀。脂肪细胞层由脂肪细胞和附着于其上的细胞（包括ARMs）组成。荧光显微镜观察显示，在高脂饮食（HFD）喂养的小鼠附睾白色脂肪组织（eWAT）中，活脂肪细胞周围存在ARMs，且随着HFD喂养时间延长，ARMs逐渐增加。考虑到脂肪细胞对机械应力和剧烈温度变化的脆弱性，采用含1mm珠子的涡旋振荡破坏脂肪细胞，随后进行低温离心以获得含有ARMs的细胞沉淀。通过FCM分选，从这些细胞和SVF中分别获得巨噬细胞，即ARMs和SVF巨噬细胞（SMs）。
接下来，检测了ARMs在正常饮食（ND）和HFD喂养小鼠的腹股沟白色脂肪组织（iWAT）和eWAT中的分布。流式分析显示，无论在ND还是HFD条件下，eWAT中的ARMs和SMs丰度均远高于iWAT。此外，肥胖导致eWAT中ARMs增加，但iWAT中无此变化。为阐明肥胖进展过程中ARM丰度的变化，使用FCM分析了不同HFD喂养时长小鼠eWAT中ARMs的动态。与先前报道一致，在HFD喂养期间，脂肪垫中SMs总数显著增加。然而，经体重标准化后，SMs数量在HFD过程中保持稳定，而ARMs在ATM中的数量和比例则随肥胖进展而增加。至HFD第14周，ARMs构成eWAT中超过70%的ATMs，表明ARMs是与肥胖相关的主要ATM群体。
2.2 SM向ARM转化及原位增殖驱动肥胖中ARM积累
为阐明肥胖期间eWAT中ARMs积累的机制，通过Ki67染色和EdU掺入进行了FCM分析以确定ARMs和SMs的增殖情况。HFD喂养促进了ARMs和SMs的增殖。值得注意的是，在ND和HFD条件下，ARMs的增殖率均约为SMs的两倍。这表明增殖程度增加有助于肥胖诱导的ARMs积累。
接下来，为探究单核细胞浸润对HFD条件下ARMs积累的贡献，建立了照射-骨髓移植嵌合体小鼠模型。成功建立嵌合，约40%的循环单核细胞为供体来源（CD45.1+），ND和HFD组间无显著差异。在HFD喂养8周时，ARMs和SMs中CD45.1+细胞的比例与ND对照组相当。相比之下，HFD喂养14周导致两个亚群中供体来源细胞显著增加。这些发现表明，单核细胞浸润在肥胖早期对ATM积累作用微乎其微，但在长期HFD暴露下贡献有限，与先前报道一致。值得注意的是，在两种饮食条件下，ARMs中供体来源（CD45.1+）细胞的比例均低于SMs，表明肥胖中观察到的ARM/SM比值升高并非源于单核细胞募集。
最后，为检验HFD是否能诱导SMs向ARMs转变，进行了SMs过继转移实验，将来自ND小鼠的CFSE标记SMs注射到ND或HFD小鼠的eWAT中，并在注射2天后评估ARMs和SMs中CFSE标记巨噬细胞的比例。在ND小鼠的eWAT中，仅20%的CFSE标记SMs转化为ARMs。然而，在HFD条件下，该比例显著上升至近50%。这一结果表明，与ND条件相比，HFD条件下SMs细胞转化为ARM的倾向更高。值得注意的是，转化为ARMs的SMs表现出更高的CAV-1表达，而CAV-1敲除则减少了SM向ARM的转化。总之，HFD诱导的eWAT中ARMs积累主要归因于增殖增加和从SMs转化共同作用。
2.3 ARMs展现黏附与脂质积累的基因图谱
为确定ARMs的转录特征，对从ND或8周HFD喂养小鼠eWAT中分选纯化的ARMs和SMs进行了RNA测序（RNA-seq）分析。在ND小鼠中鉴定出258个ARM特异性基因和8个SM特异性基因，在HFD小鼠中鉴定出354个ARM特异性基因和23个SM特异性基因。无偏聚类和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析表明，在HFD小鼠ARMs中主要表达的基因富集于细胞黏附和脂质代谢相关通路。SM特异性基因则与吞噬作用和内吞作用（Lpr8和 Cd209d）以及细菌清除（Serpinb1a， Wfdc17）相关。值得注意的是，ND小鼠ARMs中富集的KEGG通路与HFD小鼠相似，ND-ARMs中富集的几个黏附相关通路在HFD-ARMs中也存在。这些结果表明，ARMs和SMs激活了不同的转录程序，可能由细胞类型特异性调控元件介导，尤其是在ARMs内部。
为识别驱动ARMs或SMs功能性不同转录组的细胞类型特异性染色质调控元件和转录因子（TFs），进行了转座酶可及染色质测序（ATAC-seq）。差异峰分析识别出2219个ARM特异性和478个SM特异性ATAC-seq峰，表明这些细胞亚群间存在不同的染色质可及性模式。通过KEGG分析验证了与各自峰相关的细胞类型特异性基因，确认了ARMs的细胞黏附通路（Rap1信号和黏着斑通路）和SMs的FcγR介导的吞噬作用基因程序。为阐明驱动ARM和SM特异性基因程序的TFs，在细胞类型特异性峰内进行了已知基序搜索。ARM特异性峰富集了AP-1家族TFs，包括JunB、Fra1、BATF、Atf3和AP-1，而SM特异性峰则主要由ETS家族因子（Elf4、Elf5、PU.1、PU.1–IRF8和Elf3）主导。Western印迹显示HFD ARMs中AP-1表达增加，而PU.1蛋白水平在ARMs和SMs间相似。对公共数据集中巨噬细胞cistromes的综合分析显示，AP-1和ATF3的结合在ARM特异性峰处富集，表明TF结合位点与ARM特异性增强子之间存在高度相关性，以维持黏附相关基因的转录。
为确定ARMs的蛋白质组学特征，对从ND或8周HFD喂养小鼠eWAT中分选纯化的ARMs和SMs进行了蛋白质组学分析。在ND小鼠中，鉴定出67个ARM特异性和34个SM特异性蛋白；在HFD小鼠中，检测到162个ARM特异性和68个SM特异性蛋白。KEGG分析表明，ARM富集的蛋白主要与细胞黏附和脂质处理通路相关。与ND小鼠相比，HFD下的ARMs和SMs均表现出低度促炎状态。总之，ARMs独特的转录组部分由特定TFs组合激活的独特染色质景观塑造，表明ARMs具有增强的细胞黏附和脂质处理能力。
2.4 ARMs展现强大的黏附特性
ARMs牢固附着于脂肪细胞，无法通过胶原酶消化从脂肪细胞解离。RNA-seq数据显示ARMs中黏附相关基因表达模式升高。为确认这些数据，进行了逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）分析，比较了ARMs和SMs中黏附相关基因的表达。细胞-基质黏附分子（Col6a1， Itga1， Itgb5， 和 Itgax）和细胞-细胞黏附分子（Itga1， Itgb5， Itgax， Mcam， Vcam， Cd9， Cdh5， Cadm1， Pcdh1， 和 Cav1）的mRNA水平在ARMs中均显著高于SMs。为验证ARMs和SMs之间黏附能力的差异，首先检测了ARMs和SMs在基质胶包被的细胞培养皿上的附着情况。来自ND或HFD喂养小鼠的ARMs在培养皿上的黏附率均高于SMs。接着，进行了巨噬细胞-脂肪细胞黏附实验。一致地，来自ND和HFD喂养小鼠的ARMs在脂肪细胞表面的黏附率均高于SMs。由于大多数黏附分子表达在细胞膜表面，使用FCM表面染色测量了细胞黏附分子CD144（CDH5）、CD9和CD49a（ITGA1）在ARMs和SMs细胞膜上的表达。在肥胖小鼠中，ARMs的CD144、CD9和CD49a水平升高，而在瘦小鼠中CD49a增加。预处理BIO1211并未降低ARMs与脂肪细胞之间的黏附率，表明α4整合素在本实验体系中不太可能介导这些相互作用，尽管有报道称其参与脂肪细胞-巨噬细胞黏附。这些数据共同表明ARMs具有增强的黏附能力。
2.5 ARMs拥有强大的脂质积累能力
转录组分析揭示了ARMs中与脂质代谢相关基因的显著富集。在ND小鼠中，ARMs表现出与脂质合成（Dgat2， Pcx）和脂滴形成（Cavin1， Cavin2， Cidec， Hilpda， Plin1， 和 Plin4）相关的多种脂质代谢方面基因的高表达。除了ND条件下观察到的上调基因谱外，HFD背景下的ARMs还表现出进一步的脂质处理相关特征，包括脂肪酸转运（Fabp4， Fabp5， Scarb1）、新生脂质合成（Fasn， Thrsp， Scd1）和脂肪生成（Pparg）。基因特征分析表明，ARMs调节脂肪组织中的脂质代谢，促进脂质合成和稳定的中性脂质储存，尤其是在HFD条件下。事实上，与同组小鼠的SMs相比，HFD喂养小鼠的ARMs中存在更大、更多的中性脂滴。
为确定ARMs中脂质储存增加是否源于脂质摄取增加，在添加BODIPY FL C12 25分钟后量化了脂肪酸摄取。荧光显微镜显示，来自ND小鼠的ARMs和SMs之间的荧光强度无显著差异。然而，在HFD条件下，ARMs的荧光强度明显高于SMs。此外，在ND条件下，与脂质转运相关的基因（如Fabp4， Fabp5， Scarb1， 和cd36）在ARMs和SMs之间的表达未检测到统计学上的显著差异。一致地，由于SCARB1和CD36促进脂肪酸摄取，评估了ATMs中SCARB1和CD36的蛋白表达。在ND小鼠中，SMs和ARMs中SCARB1+和CD36+的比例无显著变化。在HFD条件下，与SMs相比，ARMs的Fabp4， Fabp5和Scarb1表达显著增加。此外，与SMs相比，ARMs表现出更高的SCARB1+和CD36+比例。这些结果表明，在HFD条件下，ARMs具有增强的脂质摄取能力。
接下来，为测试ARMs是否在将脂肪酸转化为中性脂质储存方面表现出更高的效率，进行了BODIPY染色的FCM分析，以测量与油酸（OA）孵育的ARMs和SMs中细胞内中性脂质积累。在ND条件下，ARMs和SMs显示出相当的细胞内脂质基线水平。然而，OA处理后，ARM中的脂质含量显著增加，而SMs中保持不变，表明ARMs在将外源脂肪酸转化为中性脂质方面表现出更强的能力。在HFD条件下，ARMs的基线细胞内脂质水平明显高于SMs。此外，与ND喂养小鼠相比，ARMs（而非SMs）的基线脂质含量显著增加，表明ARMs在肥胖状态下可能优先充当脂质缓冲器。OA处理进一步增加了HFD下两个亚群的中性脂质积累，ARMs再次显示出比SMs更高的水平。与这些发现一致，ARMs表达更高水平的参与脂滴形成的基因，包括Cavin2， Cidec， Plin1和Plin4，并且在ND和HFD条件下，与SMs相比，ARMs表现出更高的脂滴蛋白PLIN1+比例。为评估ARMs中的脂质积累是否反映了脂肪酸氧化减少，检测了脂肪酸β-氧化（FAO）相关基因表达，并直接测量了ND和HFD下ARMs和SMs中的FAO活性，未观察到显著差异。总之，这些数据表明ARMs具有增强的脂质摄取和储存能力。
2.6 HFD条件下ARMs吞噬能力较低
吞噬作用是巨噬细胞在广泛生理和病理条件下发生的一项重要功能。随后，检验了ARMs是否表现出摄取除游离脂肪酸（FFA）外其他物质的能力。比较了从ND和HFD小鼠eWAT中分离的SMs和ARMs对葡聚糖和大肠杆菌的吞噬作用。来自ND小鼠的ARMs和SMs的葡聚糖和大肠杆菌吞噬作用无差异。然而，在HFD条件下，与SMs相比，ARMs表现出减弱的吞噬能力。为评估ARMs和SMs的体内吞噬能力，向ND或HFD喂养小鼠静脉注射FITC标记的葡聚糖。30分钟后，进行FCM分析以评估eWAT中葡聚糖+巨噬细胞的比例。在HFD条件下，ARMs的葡聚糖+比例低于SMs，ND条件下无显著差异，表明ARMs吞噬能力受损。此外，在HFD条件下，ARMs表达的吞噬相关基因（Cd209d和 Wfdc17）水平远低于SMs，但在ND条件下则不然。总体而言，这些发现表明，在ND条件下，ARMs在吞噬葡聚糖和细菌等物质方面并不优于SMs，在HFD条件下其性能甚至可能更差。
2.7 CAV-1表达表征ARMs
接下来，旨在识别ARM功能的关键调节因子。胶原是细胞外基质（ECM）的主要成分，胶原酶降解ECM网络可破坏细胞-基质相互作用，同时保留细胞-细胞黏附。由于ARMs与脂肪细胞的相互作用能抵抗胶原酶消化，免疫荧光进一步表明ARMs直接黏附于脂肪细胞。通过分析RNA-seq数据，识别了ND和HFD条件下ARMs中与细胞-细胞黏附相关的上调基因。ND和HFD组共有的基因包括Cav-1、Dpep1和Aoc3。其中，只有CAV-1与细胞黏附和脂质处理均有关联。此外，CAV-1是一种细胞膜蛋白，其作为免疫细胞标志物的作用仍有待探索。因此，推测CAV-1是ARMs的细胞表面标志物，也是控制ARM功能的关键调节因子。
为验证CAV-1作为ARM特异性标志物，进行了免疫荧光和FCM分析。CAV-1在ARMs中高表达，超过85%的ARMs为CAV-1+，而少于3%的SMs为CAV-1+。还检测了脂肪组织中其他免疫细胞（包括T细胞、B细胞和DCs）的CAV-1表达，发现这些细胞中CAV-1表达极少。还重新分析了已发表的小鼠eWAT和人类白色脂肪组织的单细胞和单核RNA测序数据集。脂肪组织的单细胞RNA测序通常涉及胶原酶消化以分离SVF细胞，然后进行测序。相比之下，单核测序绕过了组织解离，直接分离细胞核，从而保留了所有细胞类型的转录组信息，包括那些嵌入脂肪细胞层的细胞。理论上，与脂肪细胞区室紧密相关的ARMs将优先被单核测序而非单细胞测序捕获。确实，重新分析数据显示，CAV-1+巨噬细胞在单核数据集中很容易检测到，但在单细胞数据集中几乎不存在。这些发现表明，CAV-1+巨噬细胞由于黏附于脂肪细胞而在很大程度上被排除在SVF之外。此外，FCM分析显示，HFD喂养的肥胖小鼠中CAV-1+ATMs的比例急剧增加，这反映了肥胖诱导的ARMs积累。免疫荧光分析也显示，在小鼠和人类的腹腔脂肪组织中，CAV-1+巨噬细胞存在肥胖诱导的积累。HFD喂养小鼠ARMs中的CAV-1表达高于ND喂养小鼠。总之，CAV-1是ARMs特异且可靠的标志物。
为确定Cav-1在调节ARM功能中的重要作用，分析了来自Cav-1缺陷和野生型（WT）小鼠eWAT的ATM区室。Cav-1?/?小鼠中肥胖诱导的ARM积累显著减少。为进一步确认免疫细胞Cav-1缺陷对ARM功能的影响，通过照射CD45.1小鼠并用来自同系WT或Cav-1?/?小鼠的骨髓细胞重建，构建了免疫细胞特异性Cav-1缺陷的小鼠。单核细胞中免疫细胞重建的效率超过70%，且WT和Cav-1?/?组间无差异。类似地，Cav-1?/?骨髓移植小鼠中肥胖诱导的ARM积累也减少。通过将Lyz2-Cre小鼠与Cav-1floxed小鼠杂交，进一步建立了巨噬细胞特异性Cav-1敲除小鼠（MKO）。与Cav-1f/f小鼠相比，从MKO小鼠分离的ATMs中Cav-1水平显著降低，表明成功删除了Cav-1。MKO小鼠中肥胖诱导的ARM积累显著减少。此外，Cav-1?/?小鼠中剩余的ARMs与WT小鼠相比表现出受损的黏附能力。此外，Cav-1?/?小鼠、Cav-1?/?
