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抗内部素A/B单克隆抗体开发及乳制品中单细胞蛋白检测的ELISA优化研究。
Mariya Divanshi | Jitesh Tarak | Shreya Saha | Namita Narwal | Rashmi Hogarehalli Mallappa | Diwas Pradhan | Sachinandan De | Raghu Hirikyathanahalli Vishweswaraiah
印度哈里亚纳邦卡纳尔ICAR-NDRI国家牛奶质量和安全参考中心微生物学部门，邮编132001
摘要
单核细胞增生李斯特菌是一种主要的食源性病原体，因此快速、高度特异性的免疫检测工具对于乳制品食品系统的监测至关重要。本研究报道了一种基于表位导向的策略，用于开发针对内毒素A（Inl A）和内毒素B（Inl B）的抗体，并将其应用于单核细胞增生李斯特菌的ELISA检测中。从三个参考菌株中成功扩增出了inlA基因，证实了相关血清型中的目标序列一致性。通过多参数计算机预测，鉴定了Inl A表面暴露区域中的19个高亲水性和抗原性的氨基酸肽段以及Inl B蛋白中的21个具有相同性质的氨基酸肽段，并用这些肽段免疫兔子。所获得的多克隆抗体表现出强烈的肽段特异性结合能力，且在连续洗涤后滴度显著提高（p < 0.05）。纯化的Inl A/Inl B抗体在点印迹/ELISA检测中能够选择性识别单核细胞增生李斯特菌，其交叉反应主要归因于金黄色葡萄球菌的Protein A的干扰。间接ELISA显示光密度与细菌浓度之间存在强线性相关性（R2 = 0.982），检测限为4.30 ± 0.02 CFU/ml。采用抗-Inl A（捕获）和抗-Inl B（检测）的双表位夹心ELISA进一步提高了特异性，检测限达到4 log CFU/ml，同时有效区分了单核细胞增生李斯特菌与亲缘关系较近的Ivanovii李斯特菌和非致病性的Innocua李斯特菌。当应用于经过短期富集的人工污染牛奶时，夹心ELISA能够检测到低至1.15 log cfu/ml的菌株，且检测结果不受基质影响。这项工作首次展示了基于表位预测的Inl A/Inl B抗体，能够可靠地区分致病性李斯特菌种类，并支持在乳制品中的敏感检测。
引言
单核细胞增生李斯特菌是一种革兰氏阳性、兼性厌氧的杆状细菌，广泛存在于土壤、水、植物和食品中。它能在广泛的温度范围内（1–45°C，最适温度30–37°C）生长，包括冷藏条件，对食品系统构成持续威胁（Hein等人，2011年）。李斯特菌属属于厚壁菌门（Firmicutes）和李斯特菌科（Listeriaceae），包含17个物种，其中单核细胞增生李斯特菌和Ivanovii李斯特菌被认为是主要的食源性病原体（Orsi和Wiedmann，2016年）。单核细胞增生李斯特菌是主要的人类病原体，可引起李斯特菌病，这是一种严重的疾病，会导致脑膜炎、败血症和流产，尤其是在易感人群中。该菌首次于1929年被发现，并在20世纪80年代因高死亡率暴发事件而受到关注，其中一起事件与美国软质奶酪有关（Jackson等人，2016年；Hof，2003年）。即食食品消费量的增加导致了李斯特菌病发病率的上升，乳制品往往是其中的罪魁祸首（Ferreira等人，2014年）。
单核细胞增生李斯特菌与其他李斯特菌物种相比，具有更高的发病率和死亡率。它包含13个血清型，其中1/2a、1/2b和4b型引起大多数人类感染，而其他血清型主要影响动物。其致病性由多种毒力因子驱动，如李斯特菌溶素O、内毒素（InlA、InlB）、李斯特菌粘附蛋白（LAP）、ActA和正向调节因子（PrfA）。表面蛋白InlA、InlB和LAP通过分别与E-钙粘蛋白（E-cadherin）、Met和Hsp60结合来促进与宿主的相互作用。尽管LAP缺乏特异性锚定结构，但InlB有助于其表面定位。InlA和InlB利用LPXTG基序和GW模块锚定在细菌细胞壁上，而作为管家蛋白的LAP则在InlB的帮助下定位于细胞表面，尽管它本身没有锚定结构。这些毒力因子共同使细菌能够侵入上皮细胞、逃逸吞噬体、在细胞内移动并在细胞间传播。这些机制导致了严重的临床后果，如败血症、脑膜炎和免疫功能低下个体的胎儿丢失（Alía等人，2024年；Liu等人，2023年）。
单核细胞增生李斯特菌通常通过针对表面蛋白InlA和InlB的抗体在生物传感器系统中进行检测（Lopes-Luz等人，2023年；Soni等人，2018年）。标准检测方法包括ISO 11290、FDA-BAM、USDA-FSIS和印度IS 14988（第1部分）：2020（适用于乳制品）（Gasanov等人，2005年）。虽然传统培养方法仍在使用，但PCR、DNA微阵列、NASBA和LAMP等分子技术提供了更快、更敏感的检测方法（Law等人，2015年）。PCR仍是血清分型和暴发追踪的关键工具，此外还有脉冲场凝胶电泳（PFGE）、多毒力位点序列分型（MLST）、噬菌体分型和核型分型（Huang等人，2015年；Nadon等人，2001年）。从基因型上看，单核细胞增生李斯特菌分为三个系统发育分支：第一分支（血清型4d、4b、4e、3b、1/2b），第二分支（血清型1/2a、3a、1/2c、3c），第三分支（血清型4a、4c）（Borucki和Call，2003年），这使得在即食食品和冷冻食品中实现快速准确的检测成为可能。利用抗体、蛋白质或凝集素作为识别元素的生物传感器正成为特定和快速检测单核细胞增生李斯特菌的有前景的工具，具有现场应用的潜力（Liu等人，2023年；Raghu和Kumar，2020年）。
B细胞表位被B细胞受体或抗体识别，对于确保宿主-病原体相互作用以及开发诊断方法、疫苗和治疗方法至关重要。这些表位可以是线性的（连续的氨基酸序列），也可以是构象性的（依赖于三维蛋白质结构）（Saha和Raghava，2006年）。计算机预测工具如BepiPred、ABCpred、IEDB Analysis Resource和ElliPro加速了表位的鉴定（Jespersen等人，2017年；Ponomarenko和Bourne，2007年），支持针对包括单核细胞增生李斯特菌和沙门氏菌等病原体的应用（Liu等人，2023年；Lopes-Luz等人，2023年）。然而，构象表位的预测仍然具有挑战性，通常需要通过ELISA、表面等离子体共振（SPR）或X射线晶体学进行实验验证（Sanchez-Trincado等人，2017年）。
在当前研究中，我们在三个关键方面进行了创新。首先，我们利用生物信息学指导的线性B细胞表位预测，选择了一个暴露在表面的高亲水性Inl A表位及其对应的Inl B表位，然后生产了针对这些区域的多克隆抗体，这与之前使用整个细胞提取物、全长蛋白或噬菌体展示衍生的结合剂的Inl A/Inl B免疫测定方法不同（Karamonová等人，2003年；Mendonca等人，2012年；Lopes-Luz等人，2023年）。这种方法减少了背景噪音和非特异性结合，后者在使用粗抗原的实验中经常发生干扰。其次，我们发现了抗体结合的介质依赖性变化，这是以前未报道过的。第三，我们通过结合表位预测的抗-Inl A（捕获）和抗-Inl B（检测）抗体在双表位夹心ELISA中定量分析了金黄色葡萄球菌的干扰作用。这提供了有用的方法（蛋白质A阻断和/或单克隆抗体开发），以提高复杂样品（如牛奶）中的检测特异性。这些进展突显了以往基于内毒素的检测方法的局限性，并为针对单核细胞增生李斯特菌的内毒素检测提供了一个合理的设计框架。
培养物的获取与维护
本研究使用了多种细菌菌株，包括单核细胞增生李斯特菌（ATCC 19118、ATCC 19115、MTCC 1143）、Innocua李斯特菌（ATCC 3390）、Ivanovii李斯特菌（ATCC 19119）、金黄色葡萄球菌（ATCC 29213）、粪肠球菌（ATCC 14506）、马链球菌（ATCC 6939）、蜡样芽孢杆菌（ATCC 14579）、肺炎克雷伯菌（ATCC 13883）、肠沙门氏菌（ATCC 35664）、普通变形杆菌（ATCC 2059）、大肠杆菌（ATCC 8739）和弗莱克斯纳志贺菌（ATCC 12022），所有菌株均来自美国典型培养物库（American Type Culture Collection）。
检测单核细胞增生李斯特菌菌株中的inlA基因
从单核细胞增生李斯特菌 ATCC 19118、ATCC 19115和MTCC 1143中提取了纯化的基因组DNA。在琼脂糖凝胶电泳中观察到清晰的条带，没有拖尾现象，表明DNA纯度足够。由于有效的扩增需要足够的浓度和纯度，因此将DNA浓度（400–500 ng/μL）稀释至小于100 ng/μL以用于PCR（Baptista等人，2021年）。所有三个菌株的inlA基因（约2.5 kb）均被有效扩增并通过凝胶电泳验证（图3）。
结论
从分子水平确认参考菌株中的inlA基因开始，到系统性的免疫原设计、抗体生成和多平台检测验证，本研究成功开发并评估了针对单核细胞增生李斯特菌 InlA和InlB的表位导向多克隆抗体。通过使用计算机预测的方法，提高了诊断特异性并降低了背景噪音，这是以往基于InlA/InlB的免疫测定方法的一个显著缺点。
CRediT作者贡献声明
Mariya Divanshi：撰写初稿、验证、方法学设计、实验实施、数据管理。
Jitesh Tarak：方法学设计、实验实施、数据管理。
Shreya Saha：撰写、审稿与编辑、实验实施。
Namita Narwal：撰写、审稿与编辑。
Rashmi Hogarehalli Mallappa：撰写、审稿与编辑、数据分析、概念构思。
Diwas Pradhan：监督工作、资源协调。
Sachinandan De：监督工作、方法学设计、数据分析、概念构思。
同意声明
已获得所有参与研究的受试者的书面知情同意。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
作者感谢印度医学研究委员会（ICMR）ID: 2020-2803（文件编号5/9/1320/2020-Nut）。作者还要感谢ICAR-国家乳品研究所（位于印度卡纳尔）的所长Arun Bhunia博士、普渡大学教授以及NAHEP提供的必要资源，以完成本研究工作。
