《Journal of Molecular Liquids》：Combination of tween 80 with milk protein fractions as novel emulsifiers for stabilizing nanoemulsions formed by low-energy method: effect on particle properties and microstructure
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通过酪蛋白水解物（CSNH）和αs1-酪蛋白肽（αs1P）与吐温80复配制备稳定O/W纳米乳液，研究显示CSNH单独使用时乳化效果优于αs1P，但复配后αs1P体系（如1:1比例）能获得更小粒径（PDI更优）。纳米乳液稳定性测试表明，混合体系（如吐温80:CSNH 2:1或吐温80:αs1P 1:1）在环境压力下表现更优，长期储存时界面层流失速率低于单一成分体系。
Rajeev Kumar | Shaik Abdul Hussain | Prateek Sharma | Rajan Sharma | R.R.B. Singh
Phulo Jhano Murmu乳品技术学院，Dumka 814145，贾坎德邦，印度
摘要
在本研究中，尝试通过逐步向油-表面活性剂混合物中加水，利用乳液相转化方法，部分用酪蛋白衍生物肽替代Tween 80来制备稳定的水包油（O/W）纳米乳液。实验中使用了中链甘油三酯（MCT）油（0.5%、1%和2% w/w）和Tween 80来选择合适的O/W纳米乳液制备条件。所选配方包含2%的MCT油和2的表面活性剂与油的比例（SOR）。Tween 80被酪蛋白衍生物肽替代，即酪蛋白水解物（CSNH）（<3 kDa）和α_s1-酪蛋白肽（f1–23）（α_s1P），替代比例分别为1:1、1:2和2:1。单独使用时，CSNH在吸附性能上优于α_s1P；然而，当与Tween 80联合使用时，α_s1P产生的液滴尺寸更小。Tween 80:CSNH（2:1）和Tween 80:α_s1P（1:1）的乳化剂组合比其他组合获得了更小的颗粒尺寸和更低的PDI值，表明界面特性受到乳化剂浓度的影响。Zeta电位值证实了在不同Tween 80浓度下α_s1P与CSNH之间的界面复合现象。由CSNH和Tween 80组合制备的纳米乳液在环境应力条件下更加稳定，储存稳定性也更好。储存第0天的透射电子显微镜观察显示界面相互作用与Zeta电位测量结果一致；但在储存第30天，Tween 80:CSNH（2:1）组分的界面层损耗比Tween 80:α_s1P（1:1）组分的损耗更严重。本研究表明，通过部分用酪蛋白肽替代Tween 80可以制备出稳定的纳米乳液。
引言
水包油（O/W）纳米乳液的颗粒尺寸较小，直径范围为20–500 nm。由于其微小的尺寸，纳米乳液被认为比传统乳液具有更好的光学透明性和动力学稳定性[1]。光学透明度对于开发透明食品（如强化水、软饮料和果汁）非常重要，而动力学稳定性则确保了纳米乳液在储存过程中的稳定性[2]。亲脂性生物活性成分（如ω-3脂肪酸、油溶性维生素和精油）在水中的溶解度较低，将其纳入基于乳液的递送系统可以提高其溶解度。多项研究表明，将这些成分纳入纳米乳液中可以保持其生物活性，并改善其稳定性和生物利用度[3][4]。
纳米乳液可以通过高能或低能方法制备。高能方法通常使用微流化、高压均质化和超声波等复杂设备[5]。这些方法操作简便，但由于成本高昂且不适用于热敏感分子（尤其是脂肪酸、维生素和肽），应用范围有限。低能方法可根据操作方式分为不同类型，例如自发乳化（在有无表面活性剂的情况下将一种相加入另一种相）、相转化温度（温度变化在乳液形成中起关键作用）、相转化组成（逐步改变油/水比例）以及乳液相转化（EPI；物理参数的变化，如内部体积分数、表面活性剂的HLB值变化、剪切速率、温度等）[6]。EPI方法是制备纳米乳液的最有效低能方法之一，因为其应用简便。在EPI方法中，通过缓慢向油-表面活性剂混合物中加水并在温和混合条件下进行乳液制备[7]。初始时为水包油（W/O）相，随后在中间阶段转变为层状液晶相（O/W/O），最终通过连续混合逐渐加入水相形成O/W纳米乳液[8]。低能方法成本较低且环保，主要基于系统内的化学能（界面自由能的变化；由于界面张力的变化导致的表面活性剂堆积和曲率自由能的变化；以及热力学变化导致的能量变化，如组成变化和表面活性剂头基的水合/脱水等），因此有时可能需要较高浓度的表面活性剂，这可能带来健康风险[9]。合成表面活性剂在高剂量下具有毒性[10]，可能导致器官积累并引发肝脏损伤[11]。因此，为了应对合成表面活性剂带来的健康问题，研究人员开始关注天然表面活性剂。
蛋白质是天然的乳化剂，可用于稳定乳液。蛋白质在油滴周围形成保护性界面层，防止其絮凝和聚集[12]。酪蛋白作为乳化剂广泛应用于食品领域。然而，酪蛋白在pH 4.6时容易发生等电沉淀，从而在环境应力条件下导致乳液不稳定[13][14][15]。与小分子表面活性剂相比，大分子（如酪蛋白）在新的界面上的吸附能力较弱[16]，这使得它们不适合用于低能乳液。有限的酶解可以使蛋白质产生具有更高柔韧性和溶解度的肽，从而改善其作为乳化剂的性能[17]。胰蛋白酶水解酪蛋白产生的C端和N端肽具有比原始蛋白质更好的乳液形成能力[18]。一些最新研究专注于选择具有良好亲水性和疏水性平衡的肽，以制备稳定的乳液。van der Ven、Gruppen、de Bont和Voragen[19]研究了不同程度酪蛋白水解后获得的肽的乳化能力，发现大于2 kDa的肽可以提高乳液稳定性。他们建议最小链长应超过20个残基以获得良好的表面活性[20]。Panyam和Kilara[21]从胰蛋白酶水解酪蛋白中分离出四种具有优异乳液形成能力的肽。Kaminogawa、Shimizu、Ametai、Lee和Yamauchi[22]证明从α_s1酪蛋白中获得的肽片段（1–23个氨基酸残基）具有优异的乳化活性。因此，可以使用肽混合物或特定肽来制备稳定的纳米乳液。
然而，肽的功能也受环境条件的影响，例如介质中是否存在酸、碱、盐和其他带电分子。因此，仅用这些肽制备的乳液也可能容易不稳定。为了形成稳定的乳液，可以将蛋白质水解物/肽与小分子表面活性剂结合使用。当使用混合乳化剂组合时，竞争性吸附、共吸附和界面复合等机制在稳定乳液方面起着重要作用[23][24][25]。因此，为了克服单一乳化剂的局限性，最近越来越普遍采用乳化剂组合来稳定纳米乳液。研究表明，使用Tween 80和酪蛋白酸钠的组合可以提高紫苏油纳米乳液的环境稳定性[26]。Tween 80和酪蛋白酸钠之间的竞争性吸附可以防止核桃油乳液中的蛋白质氧化[27]。使用Tween 80和乳清蛋白分离物组合可以改善MCT油纳米乳液的稳定性[28]。这些研究采用了高能方法制备纳米乳液，而低能乳化技术的研究较少。本研究旨在使用酪蛋白衍生物肽和Tween 80的组合来制备稳定的低能纳米乳液，并对其物理性质、微观结构和在环境应力条件及储存过程中的稳定性进行了评估。
材料
MCT油由印度孟买的Kamayani油工业有限公司提供，该油含有60%的辛酸（C8:0）和40%的癸酸（C10:0）两种中链脂肪酸。酪蛋白酸钠（85%蛋白质；在水中的溶解度为50 mg/mL）和3× extra pure胰酶从印度孟买的SRL有限公司购买。Tween 80从美国密苏里州St. Lois的Sigma-Aldrich公司购买。离心膜过滤器（截留分子量为3 kDa）也来自...
选择适合MCT油和Tween 80纳米乳液的条件
表1显示了为选择使用Tween 80稳定的O/W纳米乳液而进行的实验组合。通过改变MCT油浓度（0.5%、1%和2% w/w）和两种SOR水平（1和2），共制备了六种实验组合。纳米乳液制备过程中的混合速度为1500 rpm。当油浓度和SOR发生变化时，观察到纳米乳液的颗粒尺寸有显著差异（P < 0.05）。
结论
研究了用酪蛋白衍生物肽替代Tween 80对使用EPI方法制备的MCT油纳米乳液稳定性的影响。结果表明，CSNH和α_s1P可以成功用于通过EPI方法制备纳米乳液。单独使用时，CSNH在颗粒尺寸、多分散指数和相分离结果方面优于α_s1P。然而，当与Tween 80联合使用时，α_s1P产生的液滴尺寸显著更小。
CRediT作者贡献声明
Rajeev Kumar：撰写原始草稿、进行研究、进行正式分析。
Shaik Abdul Hussain：监督工作、概念设计。
Prateek Sharma：撰写、审阅和编辑原始草稿。
Rajan Sharma：撰写、审阅和编辑。
R.R.B. Singh：撰写、审阅和编辑、资源管理、项目协调。
作者声明
RK进行了实验，SAH设计了实验并监督了整个工作，PS撰写了手稿，RS和RRBS对手稿进行了编辑。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
作者感谢印度农业研究委员会（ICAR）和位于哈里亚纳邦卡纳尔的ICAR-国家乳品研究所提供的必要设施。同时感谢新德里的全印度医学科学研究所（AIIMS）提供的TEM设备支持。作者还要感谢Bengaluru的LiquidCubes InnoCommerce公司的创始人兼CEO Balu Vura博士和先进技术部门负责人Sruthi Guru博士提供的实验室支持。
