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β-Lg与safranal的相互作用机制及热稳定性研究，通过光谱和MD模拟发现疏水相互作用主导的熵驱动过程，伴随部分蛋白 unfolding，为功能性乳制品开发提供理论依据。
Roya ghlamian-dehkordi|Sadegh Farhadian|Lida Momeni|Habibollah Nazem|Mohammad Gholizadeh|Sami Saad Alghamdi|Saad Ali Alshehri|Taghreed A. Majrashi|Hasinah Ali M. Alqarni|Khalida Ahmed Mohammed Ahmed|Mohammed Azhar Salim|Ziyad Ibrahim Al-Yanallah|Akhtar Atiya
伊朗德黑兰Payame Noor大学理学院生物系，邮编19395-3697
摘要
了解关键生物活性化合物如何与水中的载体蛋白相互作用对于评估其稳定性和生物利用度至关重要。本研究采用光谱学和计算方法探讨了β-乳球蛋白（β-Lg）与疏水性生物活性物质藏红花醛（SAF）之间的相互作用。紫外-可见光谱分析显示Trp周围微环境发生了变化。稳态荧光分析证实了静态猝灭机制，Kq值超过2×10^10 M^-1 S^-1。热力学数据显示标准焓变（ΔH°）为79.49 kJ mol^-1，标准熵变（ΔS°）为35.66×10^1 J mol^-1 K^-1，标准吉布斯自由能变（ΔG°）在298 K时为-26.61 kJ mol^-1，在328 K时为-37.38 kJ mol^-1。这些结果表明该过程是吸热的、由熵驱动的，并主要受疏水相互作用的影响。此外，傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析也支持了部分蛋白质构象的展开。分子动力学（MD）模拟进一步证实了这些发现，结果显示根均方偏差（RMSD）增加，根均方波动（RMSF）略有减小，且在对接能量为-20.71 kJ mol^-1时旋转半径（RG）保持稳定。总体而言，这些发现有助于开发基于乳制品的功能性食品和生物活性化合物的递送系统。
引言
了解小分子生物活性物质的药理行为、稳定性和生物利用度在很大程度上取决于它们与载体蛋白的相互作用[1]。藏红花醛（SAF），化学名称为2,6,6-三甲基-1,3-环己二烯-1-羧醛，是藏红花中的主要香气成分（图1）。它占从藏红花柱头中提取的挥发油的30–70%，但其占香料总干重的比例仅为0.001–0.006%[2]。SAF具有很强的抗氧化活性[3]，能天然抵抗戊四唑（PTZ）诱导的癫痫发作[4]，并在体外对某些癌细胞系表现出细胞毒性[6],[7]。然而，由于其稳定性低、水溶性有限以及在光照、高温和pH变化等生理条件下的易分解性，限制了其实际应用[8]。因此，正在探索其与天然载体蛋白（如β-乳球蛋白（β-Lg）的相互作用，以增强SAF的分布和生物利用度（见图2）。
β-Lg是乳清蛋白的主要成分，属于脂质运载蛋白家族，以其通过蛋白水解释放生物活性肽的能力而闻名[9],[10]。这些肽具有抗氧化、抗菌和抗增殖特性[11]。β-Lg内部腔体设计用于结合疏水性化合物（如维生素和脂肪酸）[12]，使其能够有效地在富含支链氨基酸和必需氨基酸的牛奶中运输小分子生物活性物质，从而提高牛奶的营养价值[13]。此外，β-Lg的功能特性在制药、化妆品和食品应用中发挥着重要作用。
尽管先前的研究使用荧光、FTIR和计算方法等光谱技术研究了β-Lg与SAF的相互作用，但这些研究主要集中在结合机制、构象变化（如β-折叠片含量的增加）以及营养保健品的整体包封潜力上。然而，这些研究并未探讨β-Lg-SAF复合物的热稳定性及其在乳制品系统中的相关性。我们的研究通过结合热诱导的蛋白质构象变化实验来测量不同SAF浓度下的熔化温度变化，填补了这一空白，提供了关于由疏水相互作用主导的结合过程的新见解，为设计热稳定的基于蛋白质的递送系统提供了实际应用价值，尤其是在需要承受巴氏杀菌等加工条件的乳制品中。
化学溶液配制
β-Lg（产品代码：L0130）和SAF（目录编号：W338907）购自Sigma-Aldrich（美国）。在pH 7.4的25 mM Tris-HCl缓冲液中制备了4 μM的β-Lg溶液，浓度通过ε = 17,600 M^-1 cm^-1在278 nm处进行测量。SAF溶解在乙醇中制成0.1 mM的储备溶液[14]。所有试剂均未经进一步纯化使用。补充溶液使用双蒸馏水制备，所有材料储存在277 K的冷藏条件下
紫外-可见光谱分析
吸收光谱技术是一种可靠且常用的方法，可用于检测配体结合时蛋白质的结构变化，从而观察复合物的形成。
[36],[37],[38]。图2A显示，随着SAF浓度（0–9.5 μM）的增加，β-Lg的紫外吸收光谱在约210 nm处出现显著吸收下降。该波长通常对应于蛋白质肽骨架的吸收，受π→π*跃迁的影响
讨论
SAF与β-Lg之间的相互作用表现为一种由熵驱动的、吸热的疏水相互作用。这一过程导致载体蛋白的部分构象展开和热不稳定。与黄酮类化合物（如姜黄素、白藜芦醇和槲皮素）的结合不同，后者通常是放热的且由焓驱动的，因为这些化合物能与花萼入口处的极性残基形成稳定的氢键[74],[75]。
结论
本研究探讨了β-Lg与疏水性生物活性化合物SAF的相互作用。多光谱分析（如紫外-可见光谱和荧光光谱）揭示了微环境的变化和静态猝灭机制。热力学数据表明，结合过程是吸热的且由熵驱动的，主要受疏水力的影响，这从正的ΔH°和ΔS°值以及负的ΔG°值中可以看出。傅里叶变换红外光谱进一步证实了结构变化
CRediT作者贡献声明
Sadegh Farhadian：研究。Lida Momeni：研究。Habibollah Nazem：研究。Mohammad Gholizadeh：研究。Sami Saad Alghamdi：研究。Saad Ali Alshehri：研究。Taghreed A. Majrashi：研究。Hasinah Ali M. Alqarni：研究。Khalida Ahmed Mohammed Ahmed：研究。Mohammed Azhar Salim：研究。Ziyad Ibrahim Al-Yanallah：研究。Akhtar Atiya：研究。
资助
作者感谢King Khalid大学的研究与研究生院通过大型研究项目（项目编号：RGP2/262/46）资助了这项工作。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
作者感谢King Khalid大学的研究与研究生院通过大型研究项目（项目编号：RGP2/262/46）资助了这项工作。
