《iMeta》：Chondroitin sulfate restores muscle mass via gut–muscle axis remodeling through sugar–bile acid metabolism reprogramming
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本研究首次揭示了膳食硫酸软骨素(DCS)通过重塑肠道菌群-宿主代谢轴，改善糖皮质激素诱导肌病的新机制。DCS特异性富集约氏乳杆菌(L. johnsonii) Z-RW，后者通过高表达胆汁盐水解酶基因(bshA)驱动胆汁酸去结合化，提高次级胆汁酸水平，并重塑肠道糖代谢平衡。重构的胆汁酸谱经肠-肌肉轴传递至骨骼肌，激活NMRK2介导的NAD?生物合成和PAX7信号通路，从而促进肌肉再生关键蛋白(MYHC, KRT18, RGN)表达，最终恢复肌肉质量和功能。这项工作为靶向肠道菌群的肌肉萎缩干预策略提供了全新思路。
INTRODUCTION
糖皮质激素(例如地塞米松)因其强效的免疫抑制和抗炎作用，在控制系统性红斑狼疮、器官移植排斥和恶性肿瘤方面仍具有不可替代的临床价值。然而，长期使用地塞米松会通过肠-肌肉轴诱导严重的肌肉萎缩，这种双向联系在人类代谢和免疫疾病中的作用日益受到关注。该轴被糖皮质激素驱动的菌群失调、泛素-蛋白酶体活性升高、线粒体功能障碍和卫星细胞功能受损所破坏，表现为近端肌肉萎缩、肌纤维类型转变和蛋白质合成减少。目前的治疗策略主要包括减量或停药，并结合康复和营养支持。然而，这些方法面临重大挑战：长期使用者往往难以维持完整的肌肉功能，而依赖糖皮质激素控制疾病(如系统性红斑狼疮、癌症或移植排斥)的患者无法中断治疗。鉴于糖皮质激素诱导的肌肉损伤常涉及多种通路的功能障碍，如能量代谢失衡、蛋白质合成抑制和氧化应激升高，亟需开发能够长期实施且不影响类固醇疗效的靶向干预措施。
与直接作用于肌纤维结构的传统药物作用模式不同，营养干预可调节代谢通路活性、增强细胞稳态调节，且毒性低。这些特性使其成为维持肌肉功能和减轻副作用的潜在安全策略。硫酸软骨素(CS)是一种结构明确、广泛可得的天然糖胺聚糖，由N-乙酰半乳糖胺和葡萄糖醛酸的重复单元组成，具有显著的代谢和免疫调节作用。在本研究中，从动物骨骼来源中获得了具有独特2-位硫酸化模式的硫酸软骨素(DCS)，其特征是高溶解度和代谢稳定性。
本研究旨在阐明：(1) DCS是否通过重塑肠道微生态改善肌肉功能；(2) DCS介导的代谢改变如何调节肌肉组织中的信号通路；(3) 沿肠-肌肉轴的这些效应是否具有剂量依赖性、菌株特异性并依赖于特定信号通路。
RESULTS
Chondroitin sulfate restores muscle mass and function in dexamethasone-treated mice
为评估硫酸软骨素(DCS)在缓解肌病症状方面的潜力，使用地塞米松诱导小鼠肌病，随后进行DCS干预。通过肌肉功能评估和组织学分析评估其效果。结果显示，DCS干预以有利的剂量依赖性方式显著改善了多项肌肉功能相关指标。高剂量组小鼠在肌肉重量、前肢握力、跑步距离、游泳速度和瘦体重方面显著优于模型组小鼠。H&E染色分析显示，DCS有效保护和重建了肌纤维的微观结构。免疫荧光染色定量分析显示，DCS干预后，MHC阳性比例呈剂量依赖性增加，高剂量组显著增加至70.29%，接近正常水平。泳池停留测试结果显示，随着DCS干预剂量的增加，运动模式显著改善。
腓肠肌组织的蛋白质组学分析显示，不同处理组间的蛋白质表达谱存在显著差异。通过聚类分析，差异蛋白被分为六大功能模块，其中C6模块在基因本体富集分析中显示出与肌肉功能密切相关的生物通路显著富集，包括肌纤维修复、肌细胞分化和能量代谢调节。Mantel检验显示，C6模块与多项肌肉指标(如肌肉质量和运动能力)呈显著正相关。基于C6模块，筛选出与肌肉功能相关的潜在关键调控蛋白，包括在肌肉再生、细胞分化和结构维持中具有重要作用的Nmrk2、Pax7和Krt18。Western Blot验证显示，DCS干预组小鼠腓肠肌中Nmrk2、Pax7和Krt18的表达水平显著上调。
L. johnsoniiZ-RW was enriched and exhibits a high capacity for DCS degradation and utilization
为阐明DCS的效应靶点，使用体内成像追踪其体内分布。结果显示，灌胃后DCS稳定通过胃肠道，并在小肠和结肠中显著富集。通过16S rRNA测序深入分析各组的肠道微生物组变化。多样性分析显示，DCS干预后多样性呈剂量依赖性U型趋势，高剂量DCS显著恢复了多样性。非度量多维尺度分析结果表明，模型组和DCS干预组的肠道菌群结构均发生显著改变，DCS干预组显示出与对照组更大的相似性。使用随机森林分类模型筛选驱动表型肌病缓解的核心菌株，该模型基于前10个特征微生物具有99%的模型准确度。这些微生物包括约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)等。DCS对约氏乳杆菌(L. johnsonii)等显示正向调节作用。倍数变化分析显示，药物治疗组中约氏乳杆菌(L. johnsonii)的丰度显著高于模型组和正常组，表明它是潜在的DCS特异性响应靶菌株。回归分析进一步显示，约氏乳杆菌(L. johnsonii)的相对丰度与DCS剂量呈显著正相关。跨域网络分析显示，约氏乳杆菌(L. johnsonii)的丰度与关键运动功能指标(如肌肉重量、跑步距离、游泳速度和握力)显著正相关，与脂肪量和水分含量负相关。
从高剂量DCS组小鼠粪便样本中分离纯化出约氏乳杆菌(L. johnsonii)菌株，命名为约氏乳杆菌(L. johnsonii) Z-RW (CGMCC 32588)。获得了该菌株的高质量环状基因组，COG功能注释显示其基因组中包含典型的胆汁盐水解酶编码基因bshA。该基因编码的胆汁盐水解酶(BSH)催化结合胆汁酸(如牛磺胆酸(TCA)、牛磺脱氧胆酸(TDCA))的酰胺键水解，产生游离初级胆汁酸和氨基酸。为验证约氏乳杆菌(L. johnsonii) Z-RW的能力以及DCS招募它的能力，在以DCS为唯一诱导剂的模拟结肠环境中，系统评估了其增殖动力学、DCS利用效率和肠道粘附潜力。结果显示，随着DCS浓度增加，约氏乳杆菌(L. johnsonii) Z-RW表现出滞后期缩短、指数生长期提前，且活菌数显著增加。在Caco-2粘附试验中，粘附率从无DCS时的30.2%上升到DCS浓度为0.5、1.0和2.0 mg/mL时的35.8%、50.0%和60.4%。在DCS利用试验中，约氏乳杆菌(L. johnsonii) Z-RW表现出比高剂量粪便菌群和其他发酵系统更快速、更广泛的降解，证明它是驱动高剂量组中高效DCS代谢的关键靶细菌。
Bile acids were enriched and promoted skeletal muscle repair, whereas small molecule sugars drove its deterioration
为阐明约氏乳杆菌(L. johnsonii) Z-RW调节骨骼肌修复的通路，进行了非靶向代谢组学分析。基于代谢组、微生物组和蛋白质组构建的结构方程模型显示出良好的整体拟合优度，其中DCS直接影响微生物群落，群落变化通过代谢物和蛋白质组间接调节肌肉表型，最终对肌肉表型具有高度的解释力。
进一步分析非靶向代谢组学数据，在偏最小二乘判别分析图中，处理组间显著分离，低、中、高剂量组呈梯度分布，剂量越高越接近对照组，表明干预效果具有显著的剂量依赖性。堆叠直方图显示，与模型组相比，DCS处理组(低、中、高)胆汁酸含量显著增加，糖含量显著降低。提取胆汁酸和糖类中的所有化合物进行层次聚类。与对照组相比，模型组中结合胆汁酸(包括TDCA、甘氨鹅脱氧胆酸(GCDCA)和TCA)的相对丰度显著升高。然而，高剂量DCS治疗逆转了这一趋势，并增加了游离胆汁酸(如熊去氧胆酸(UDCA)、乌索胆酸(UCA))的水平。相比之下，高剂量治疗组中糖代谢物(如松三糖、赤藓糖和水苏糖)显著减少。
为从机制上区分直接代谢物效应与约氏乳杆菌(L. johnsonii) Z-RW依赖的代谢重塑，在无菌小鼠中建立了结构化的补充系统。口服给予混合糖类(木二糖、甘露糖、赤藓糖和木糖)以及代表性胆汁酸(TDCA、GCDCA、TCA和HCA)，联合或不联合约氏乳杆菌(L. johnsonii) Z-RW。与模型组相比，接受联合胆汁酸接种和约氏乳杆菌(L. johnsonii) Z-RW干预的小鼠在多个运动表型(包括游泳速度和肌肉质量)以及组织结构(如肌筋膜融合减少)方面表现出显著改善。腓肠肌H&E染色进一步显示，联合胆汁酸和约氏乳杆菌(L. johnsonii) Z-RW治疗组的治疗效果与正常组非常接近，肌肉纤维结构明显恢复。
The conversion of primary bile acids into secondary bile acids promoted by L. johnsoniiZ-RW and reduces the levels of small-molecule sugars
网络分析显示，约氏乳杆菌(L. johnsonii)的相对丰度与结合胆汁酸(如TDCA、GCDCA)负相关，与游离胆汁酸(如异脱氧胆酸(ISODCA)、熊去氧胆酸(UDCA)、甘氨石胆酸(GLCA))正相关，并且与多种小分子糖(乳糖、鼠李糖和木糖)显著负相关。由于代谢物补充实验揭示初级胆汁酸的去结合和转化以及小分子糖的减少与约氏乳杆菌(L. johnsonii) Z-RW介导的代谢重塑密切相关，我们进一步对约氏乳杆菌(L. johnsonii) Z-RW的底物利用和生化转化能力进行了直接验证。
结果显示，补充DCS显著促进了约氏乳杆菌(L. johnsonii) Z-RW的增殖，12小时时活菌数比对照增加0.5–1.0 log10CFU/mL。同时底物利用加快，反映为残余糖浓度降低0.10–0.25 g/L。此外，来自DCS刺激的约氏乳杆菌(L. johnsonii) Z-RW培养物的条件培养基将C2C12肌管活力提升至对照的137–143%。在五种胆汁酸培养体系中，DCS同样使约氏乳杆菌(L. johnsonii) Z-RW丰度增加0.3–0.6 log10CFU/mL，残余胆汁酸减少至0.08–0.15 g/L，并进一步将肌细胞活力提高至150–158%。这些结果表明，在明确的底物条件下，DCS优先增强约氏乳杆菌(L. johnsonii) Z-RW的生长和代谢活性，支持其作为DCS暴露的主要代谢响应者。
使用绝对定量和靶向代谢组学进一步验证代谢和转化能力。孵育结果显示，所有单糖及其混合物在发酵后均被显著消耗，同时短链脂肪酸(如乙酸)含量增加。在胆汁酸转化方面，结合型初级胆汁酸(如TCA和GCDCA)减少，而次级胆汁酸(包括TDCA、HCA、7-酮石胆酸(7-KLCA)和熊去氧胆酸(UDCA))增加。总之，约氏乳杆菌(L. johnsonii) Z-RW表现出强大的糖发酵和胆汁酸去结合能力，在将结合的初级胆汁酸转化为次级产物方面效率显著。这些代谢特性使约氏乳杆菌(L. johnsonii) Z-RW成为DCS协调糖-胆汁酸-肌肉代谢轴重塑的核心效应器，从而将肠道微生物活性与宿主肌肉再生联系起来。
Strain transplantation combined with multi-omics recapitulates the DCS-triggered gut–muscle axis signaling pathway
为研究约氏乳杆菌(L. johnsonii) Z-RW在缓解糖皮质激素诱导肌病中的功能贡献，建立了基于无菌受体的菌株移植和粪便微生物群移植模型，包括一个额外组别，即仅接受DCS灌胃而无微生物定植的无菌小鼠。值得注意的是，仅接受DCS的无菌小鼠在肌肉功能表现或形态(通过握力、跑步距离、肌肉重量、游泳速度和腓肠肌组织学特征评估)方面未表现出明显改善。相比之下，移植来自DCS处理供体小鼠的粪便微生物群导致肌肉功能参数部分恢复，而移植约氏乳杆菌(L. johnsonii) Z-RW在所有评估指标中产生了最显著的恢复。组织学分析一致显示，约氏乳杆菌(L. johnsonii) Z-RW移植显著改善了腓肠肌结构，肌纤维排列更规则，组织形态接近对照小鼠。总之，这些结果表明，在没有肠道菌群的情况下，仅DCS不足以赋予肌肉保护作用。相比之下，被DCS改变的微生物群，特别是约氏乳杆菌(L. johnsonii) Z-RW的定植，与肌肉结构和功能的恢复相关。因此，后续的多组学分析集中在微生物定植或移植伴随肌肉表型恢复的实验条件下。
随后，进行了蛋白质组学和代谢组学分析，以评估在微生物群重建条件下，约氏乳杆菌(L. johnsonii) Z-RW是否通过调节肠道代谢物和恢复关键蛋白的表达来改善肌肉功能。据此，我们提出“糖-胆汁酸比”(SBR)作为代谢状态的定量指标，即小分子糖与游离次级胆汁酸丰度的比值。结果显示，正常小鼠中该比值为0.18，模型组增加至1.1，菌株移植组下降至0.11，表明SBR降低与微生物群重建小鼠的表型改善相关。差异代谢物分析显示，与模型组相比，菌株处理组中结合型初级胆汁酸(如GCDCA和TCA)和糖代谢物(D-(+)-葡萄糖、麦芽糖、异麦芽糖和蔗糖)的相对丰度显著降低。值得注意的是，模型组中升高的2-脱氧-d-核糖在菌株接种后也降至与对照相当的水平。相比之下，菌株接种组中次级胆汁酸(如TDCA、鼠脱氧胆酸(MDCA)和β-鼠胆酸(β-MCA))的相对丰度显著高于模型组，显示出向对照水平部分恢复的趋势。同时，与对照组相比，熊去氧胆酸(UCA)在模型组和菌株处理组中均保持降低，表明并非所有次级胆汁酸种类都能通过菌株接种完全恢复。这与之前分析的结果一致，表明在有效的微生物移植后，胆汁酸代谢重塑发挥了积极作用。
蛋白质组学分析进一步揭示，接种约氏乳杆菌(L. johnsonii) Z-RW显著上调了调节肌肉干细胞激活和NAD?再生的关键蛋白，如肌肉再生调节因子PAX7和合成限速酶NMRK2。通过PCR测定10个关键差异基因的表达，结果显示，与正常对照组相比，模型组中所有靶基因的表达均呈现显著下调趋势。其中，MyHC、Pax7和SIRT1的表达水平下调最为显著。在约氏乳杆菌(L. johnsonii) Z-RW干预后，上述基因的表达水平显著恢复，其中MyHC、Pax7和SIRT1的上调最为显著。此外，Z-RW处理也显著增加了其他与肌生成和肌肉功能相关基因(Nmrk2、Krt18、ENT1和Snd1)的转录，总体上使其表达向对照水平转变。与这些转录变化一致，模型组中NAD?和烟酰胺核糖(NR)的含量降低，而Z-RW干预显著提高了NAD?，并进一步增加了相对于模型组的NR，这一结果与初步蛋白质组学分析数据高度一致。总之，这些结果表明，在微生物群重建条件下，约氏乳杆菌(L. johnsonii) Z-RW有助于重塑肠道糖-胆汁酸代谢平衡，并与Pax7/Nmrk2/SIRT1信号通路的再激活相关，从而支持了硫酸软骨素肌肉保护作用背后的微生物依赖的肠-肌肉轴。
DISCUSSION
糖皮质激素诱导肌病是一种由长期使用糖皮质激素引起的常见代谢性肌肉疾病，其特征是肌肉萎缩、力量和耐力丧失，且症状通常难以逆转。在本研究中，我们证明膳食DCS显著减轻了小鼠糖皮质激素诱导的肌肉萎缩。重要的是，我们的数据表明，这些肌肉保护作用严格依赖于肠道微生物群的存在，而不是DCS对骨骼肌组织的直接作用。在无菌或微生物群耗竭的小鼠中，DCS给药未能改善肌肉表型，而微生物群落的恢复，特别是通过粪便微生物群移植或单一定植约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii) Z-RW，再现了肌肉功能恢复。这些发现将肠道微生物群依赖性定位为DCS疗效的先决条件，并将肠-肌肉轴定义为所观察表型的主要调控框架。
先前的研究表明，多糖不仅直接作用于肠道屏障，还会被微生物群代谢成具有生物活性的次级产物，进而影响远端组织的功能。本研究发现，DCS在调节“肠-肌肉轴”中发挥重要作用，不同剂量的DCS显著促进了益生菌(如约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii))的定植和增殖。先前的研究表明，约氏乳杆菌(L. johnsonii)在免疫调节、改善肠道健康和防治代谢性疾病方面具有重要作用。在本研究中，我们通过菌株分离和单菌灌胃实验证明，约氏乳杆菌(L. johnsonii) Z-RW在无菌小鼠的GIM模型中显著改善了肌肉功能，包括肌肉重量、跑步距离和握力。菌群衍生的次级胆汁酸(如7-KLCA和UDCA)通过TGR5促进肌肉线粒体功能和蛋白质合成，缓解炎症性肌肉萎缩表型。然而，在GIM背景下，肠道菌群与宿主肌肉功能相互作用的具体机制尚未得到系统阐明。本研究中，肠道代谢组分析揭示，约氏乳杆菌(L. johnsonii) Z-WR通过重塑肠道代谢谱、上调游离胆汁酸水平、下调糖代谢，帮助逆转骨骼肌代谢稳态失衡。这反映在恢复的线粒体功能和增加的ATP合成上，从而有效缓解了肌病症状。这些结果表明，DCS及其介导的肠道代谢物改变可能通过双向的“肠-肌肉轴”调控机制靶向骨骼肌代谢功能障碍，从而改善肌病症状。
值得注意的是，肌肉表型恢复始终与约氏乳杆菌(L. johnsonii) Z-RW定植后游离和次级胆汁酸的积累相关，而单独给予DCS在无菌小鼠中未能引发类似效果。这些发现表明，DCS对肌肉功能的有益作用依赖于微生物群介导的代谢转化，而非对宿主组织的直接作用。尽管先前的研究表明胆汁酸可能通过胆汁酸响应信号通路(包括FXR和TGR5)影响骨骼肌代谢，但本研究并未直接探究受体激活或下游信号事件。相反，胆汁酸重塑与肌肉代谢和再生程序恢复的协调发生，支持了肠道胆汁酸谱与肌肉功能之间微生物依赖的代谢联系。与这一解释一致，据报道次级胆汁酸在代谢组织中参与FXR和TGR5相关信号通路，为本研究中观察到的肌肉相关蛋白(如Nmrk2和Pax7)的调控提供了生物学上合理的背景。Nmrk2是NAD?生物合成通路中的关键酶，有助于线粒体功能和肌肉修复；而PAX7是卫星细胞激活和肌生成再生的公认标志物；KRT18可能通过维持肌纤维的结构稳定性来支持肌肉组织的完整性。这些结果进一步验证了DCS在缓解糖皮质激素诱导肌肉萎缩中的关键作用。这些结果支持次级胆汁酸作为候选代谢介质，通过肠-肌肉轴将约氏乳杆菌(L. johnsonii) Z-RW相关的代谢重塑与肌肉表型改善联系起来，为代谢物重塑参与肌肉调控提供了功能支持，而不是确定
