《Immunity, Inflammation and Disease》：Expression of Purinergic and Endothelial Activation Markers in Brain Tissue From Fatal Microcephaly Associated With ZIKV
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寨卡病毒（ZIKV）感染可导致严重的先天性小头畸形。本研究通过对致死性病例脑组织样本进行分析，发现ZIKV感染显著上调了内皮活化标志物（E-选择素、P-选择素、ICAM-1、VCAM-1）和嘌呤能受体（P2X4、P2X7、P2Y2）的表达。这些变化与神经炎症、血脑屏障（BBB）破坏及神经损伤密切相关，为理解ZIKV神经病理机制及开发靶向干预策略提供了新见解。
寨卡病毒（ZIKV）相关致死性小头畸形中脑组织内皮活化标志物与嘌呤能受体的表达
引言
寨卡病毒（ZIKV）是一种黄病毒，因其与先天性小头畸形和神经炎症反应的关联而受到全球关注。虽然内皮活化标志物和嘌呤能信号在ZIKV神经发病机制中的作用已被识别，但其潜在机制仍不清楚。ZIKV是一种不分节段的、有包膜的正链RNA病毒，其基因组编码10种病毒蛋白，在调节宿主免疫反应以及病毒复制、加工和组装中起重要作用。2015年美洲的疫情因其与格林-巴利综合征的因果关联，以及妊娠早期感染妇女所生新生儿先天性小头畸形病例的急剧增加而引发全球担忧。
从免疫致病角度来看，宿主的免疫反应对于塑造ZIKV感染的进程至关重要。在血脑屏障（BBB）的背景下，理解ZIKV神经发病机制的一个主要挑战在于阐明病毒如何感染内皮细胞并损害屏障完整性。稳态和突触信号的破坏——由星形胶质细胞、神经元和小胶质细胞之间的相互作用驱动——创造了一个细胞毒性微环境。嘌呤能受体构成一个被细胞外核苷酸激活的受体家族，在中枢神经系统（CNS）的细胞信号传导中起重要作用。在神经炎症的背景下，嘌呤能受体因其在调节胶质细胞活化和促炎介质释放中的作用而被广泛研究。
本研究旨在通过免疫组织化学方法检测内皮活化标志物（E-选择素、P-选择素、ICAM-1和VCAM-1）和嘌呤能受体（P2X4、P2X7和P2Y2），探索这些通路如何促进白细胞募集、滚动和跨内皮迁移，最终导致炎症浸润的形成和严重小头畸形的组织病理学特征。
方法
本研究对九名患者的脑组织样本进行了分析，其中六例为ZIKV诱导的致死性小头畸形病例，通过RT-qPCR阳性和/或细胞培养或免疫组织化学病毒分离确认。另外三例为阴性对照组，死于其他原因且显示神经结构保存。通过免疫组织化学程序，使用针对特定标志物的抗体进行组织免疫标记。使用抗ZIKV抗体优化了病毒抗原检测方案。主要抗体及其工作稀释度详见文中表格。定量分析使用Zen Blue软件对400倍放大下获得的光学显微镜图像进行手动细胞计数，由两名独立观察者在盲法下进行。使用GraphPad Prism 5.0软件进行统计分析，应用学生t检验和皮尔逊相关性检验，显著性水平设为5%。
结果
在ZIKV阳性的先天性小头畸形致死病例中，组织病理学检查显示脑实质内环境发生了显著改变。白质表现出明显水肿，大脑皮质显示毛细血管和内皮细胞增生，伴有明显的血管充血。组织学分析还揭示了局灶性出血区域。实质中一个突出的特征是血管周围炎症浸润和胶质结节的广泛存在。使用抗ZIKV抗体的免疫组织化学揭示了先天性小头畸形致死病例中枢神经系统中多种细胞类型的阳性。内皮免疫标记表现为棕橙色胞浆染色，表明毛细血管和小口径血管的内皮细胞中存在病毒抗原。星形胶质细胞的免疫反应性主要出现在其细胞过程中，在反应性胶质增生区域观察到弥漫模式。小胶质细胞显示出活化形态和强烈的胞浆染色。受感染的神经元表现出颗粒状胞浆免疫标记。
免疫组织化学分析显示，与对照组相比，先天性ZIKV感染新生儿大脑中内皮粘附分子的表达显著增加。观察到E-选择素、P-选择素、ICAM-1和VCAM-1阳性细胞的密度显著升高。这些分子主要沿血管内皮分布，具有强烈的膜性和胞浆染色，这与广泛的内皮活化一致。相反，对照组显示出微弱和局灶性的免疫反应性，仅限于少数孤立的血管。E-和P-选择素的伴随增加支持了它们在白细胞募集的早期阶段的作用，促进了滚动和牢固粘附的启动，而ICAM-1和VCAM-1的上调则与淋巴细胞和单核细胞向脑实质的跨内皮迁移和持续募集有关。这些发现表明ZIKV感染诱导了强烈的炎症状态，与血脑屏障功能障碍和神经炎症的放大相一致。
此外，对嘌呤能受体表达的评价显示，在先天性ZIKV感染新生儿的大脑中亚型P2X4、P2X7和P2Y2显著上调。感染大脑中阳性细胞的数量明显高于对照组。染色在血管周围和实质细胞（包括星形胶质细胞和小胶质细胞）周围特别强烈，血管周围定位和特征性的细胞形态证明了这一点。在对照组中，免疫反应性极弱且受限。为定量支持免疫组织化学发现，测量了ZIKV阳性病例和未感染对照组实质中每种内皮标志物和嘌呤能受体的每平方毫米阳性染色细胞数量。结果显示所有评估的标志物均具有统计学意义的增加，进一步证实了致命性ZIKV相关小头畸形中显著的内皮活化和嘌呤能信号失调。
讨论
从病原体-宿主关系的角度来看，参与ZIKV感染免疫发病机制（特别是致命性小头畸形病例）的免疫机制仍未完全明了。已知神经实质中血管通透性的增加可能是多种因素相互作用的结果，包括调节宿主免疫反应的内皮细胞表型。在本研究中，免疫激活标志物在ZIKV感染期间的中枢神经常驻细胞和浸润免疫细胞中均被检测到，表明存在多方面的炎症反应。细胞死亡是ZIKV诱导的小头畸形的一个标志，特别是在致死病例中。炎症细胞与表现出凋亡和坏死形态学迹象的神经元和星形胶质细胞紧密相邻，强烈表明免疫细胞浸润直接导致了组织损伤。在这种情况下，粘附分子是稳定细胞间相互作用和促进白细胞跨内皮迁移的关键介质。此外，与Th1免疫谱一致的高水平促炎细胞因子主要在血管周围区域和脑膜中被观察到，这些区域与脑膜脑炎和免疫细胞浸润相关。NF-κB信号在此过程中起着核心作用，驱动TNF-α和IL-1β等细胞因子的表达，进而刺激ICAM-1和VCAM-1的上调。
然而，理解ZIKV感染在致命性小头畸形病例中的病理生理学的最重大挑战之一在于阐明控制血脑屏障完整性和内皮调节的机制。ZIKV采用的免疫逃避策略使其能够逃避宿主的先天防御并侵入免疫豁免组织，可能导致关键的神经过程失调，并导致与感染相关的严重脑损伤和神经系统并发症。这些干扰会损害细胞间通讯，并可能涉及嘌呤能信号通路的改变。在致命性ZIKV相关小头畸形中观察到的嘌呤能受体的上调支持了兴奋性毒性（由过度的或长时间的细胞外谷氨酸积累介导）可能是一个促成因素的假设。在ZIKV免疫发病机制的背景下，炎症微环境以Th1、Th17和M1小胶质细胞活化为特征。嘌呤能受体的参与可以增强胶质细胞释放谷氨酸，导致谷氨酸受体（如N-甲基-D-天冬氨酸受体）的过度激活。这反过来会增加细胞内钙离子浓度，促进活性氧和活性氮的产生，驱动氧化应激和细胞损伤，同时损害血脑屏障的通透性。在先天性寨卡综合征中，神经炎症通过炎症小体激活而进一步增强，促进了诱导型一氧化氮合酶的表达和随后的氧化氮产生。在这种情况下，嘌呤能信号可能为神经元死亡的机制提供有价值的见解，神经元死亡以活性氧的广泛积累为标志，这对常驻和浸润的免疫细胞都极具毒性。
值得注意的是，这项研究的样本量有限，由六名受ZIKV影响的个体和三名对照组成。这对研究结果的统计稳健性是一个重要的限制。尽管参与者数量少可能限制了研究的效力，但仍有可能在分析组之间识别出统计学上显著的差异。这些结果凸显了本研究的相关性，因为它们提供了关于ZIKV感染和神经炎症的重要初步数据。考虑到可用于此类分析的样本稀缺，所获得的发现极大地促进了该领域知识的进步，可作为未来更大样本量调查的基础。
结论
致命性ZIKV相关小头畸形的免疫发病机制涉及内皮活化、白细胞募集和嘌呤能信号之间的复杂相互作用，所有这些都促进了神经炎症、氧化应激和神经元死亡。粘附分子和嘌呤能受体的表达增加凸显了免疫介导的血管功能障碍在破坏血脑屏障完整性中的核心作用。这些发现强调了进一步研究连接内皮信号传导与ZIKV感染期间兴奋性毒性的分子机制的重要性，这可能指导开发靶向疗法，以减轻先天性寨卡综合征中的神经发育损伤。
