磷酸化EZH2的线粒体易位在BRCA1缺陷型上皮性卵巢癌中促进PARP抑制剂耐药

《Cell Discovery》：The mitochondrial translocation of phosphorylated EZH2 promotes PARP inhibitor resistance in BRCA1-deficient epithelial ovarian cancer

为解决BRCA1缺陷型上皮性卵巢癌（EOC）患者对PARP抑制剂（PARPi）产生获得性耐药的难题，研究人员开展了一项关于EZH2在耐药中作用机制的研究。他们发现PARPi治疗激活YES1激酶，促使EZH2在Y728位点发生酪氨酸磷酸化，从而导致其从细胞核易位至线粒体。在pY728EZH2的催化下，线粒体蛋白MYO19发生K928位点三甲基化，进而诱导线粒体融合、抑制线粒体凋亡通路，最终驱动PARPi耐药。本研究揭示了一个全新的YES1-EZH2-MYO19翻译后修饰级联通路，并证实靶向磷酸化EZH2能重塑线粒体动态平衡、恢复肿瘤细胞对PARPis的敏感性，为克服BRCA1缺陷型EOC的PARPi耐药提供了有前景的治疗策略。

　　

卵巢癌是女性常见的妇科恶性肿瘤，其中BRCA1基因缺陷的肿瘤因DNA修复功能受损，一度被认为是PARP抑制剂治疗的绝佳对象，利用“合成致死”效应可精准杀灭癌细胞。然而，现实是残酷的，许多患者起初疗效显著，但不久后便会产生获得性耐药，导致治疗失败。这背后隐藏的机制成为临床和科研亟待解决的难题。为何这些理应敏感的肿瘤会“反戈一击”？除了已知的基因突变恢复等少数原因，是否还存在不为人知的“暗物质”通路在操控着耐药性的产生？为了揭开这个谜团，一个研究团队将目光投向了表观遗传调控的关键蛋白——组蛋白甲基转移酶EZH2，并在顶级期刊《Cell Discovery》上发表了一项突破性研究，揭示了一个从细胞核到线粒体的“信号叛逃”故事，为逆转耐药带来了新希望。

本研究综合运用了多种前沿技术方法。研究团队首先利用患者来源的类器官（PDO）进行高通量表观遗传抑制剂筛选，确定了EZH2是关键的耐药驱动因子。在此基础上，构建了PARPi耐药的BRCA1缺陷型细胞系，并通过蛋白质免疫印迹、免疫荧光、免疫共沉淀结合质谱分析、流式细胞术、透射电子显微镜等技术，深入解析了分子机制。分子对接（AlphaFold3）和体外酶活实验（磷酸化与甲基化）用于验证关键位点（EZH2 Y728和MYO19 K928）的功能。体内研究则通过建立裸鼠移植瘤模型，验证了靶向YES1或EZH2能够恢复肿瘤对PARPi的敏感性。临床样本分析包括对来自复旦大学附属肿瘤医院的BRCA1缺陷型EOC患者组织进行免疫组化、蛋白质印迹和qPCR，以验证关键蛋白的表达和相关性。

结果

A PDO-based epigenetic inhibitor screen identified EZH2 as a key regulator of PARPi resistance in BRCA1-deficient EOC

研究人员通过基于PDO的高通量表观遗传抑制剂筛选发现，只有特定的EZH2酶活性抑制剂他泽司他（tazemetostat）能显著降低PARPi耐药PDO的存活率，而其他表观调控因子抑制剂效果甚微。在构建的耐药细胞系中，EZH2表达显著上调。临床数据分析显示，高表达EZH2的患者预后更差。在裸鼠移植瘤模型中，敲低EZH2能显著增强肿瘤对PARPis的敏感性。这些结果表明，EZH2是BRCA1缺陷型EOC中PARPi耐药的一个新型驱动基因。

EZH2 drives PARPi resistance in BRCA1-deficient EOC cells independent of the PRC2 complex

临床样本和细胞实验表明，虽然EZH2在耐药组织中表达升高，但其经典功能产物H3K27me3的水平在敏感和耐药组间无显著差异。使用不同作用机制的EZH2抑制剂（如催化活性抑制剂、降解剂和PRC2复合物破坏剂）发现，抑制EZH2的催化活性或诱导其降解能克服耐药，而破坏PRC2复合物则无效。此外，敲低PRC2核心组分EED也无法消除EZH2过表达诱导的PARPi耐药。这些发现表明，EZH2是通过不依赖于其组蛋白甲基转移酶活性的非经典机制促进PARPi耐药。

YES1-induced tyrosine phosphorylation dictates the function of EZH2 in BRCA1-deficient EOC

蛋白质组学分析发现，耐药细胞中EZH2的酪氨酸磷酸化水平显著升高。通过免疫共沉淀-质谱联用分析鉴定出YES1是唯一与EZH2结合的酪氨酸激酶。实验证实，YES1在耐药细胞中被激活，并能催化EZH2磷酸化。使用YES1抑制剂CH6953755可降低EZH2磷酸化水平并恢复细胞对PARPis的敏感性。体内外实验均表明，抑制YES1或EZH2能协同增强PARPi的抗肿瘤效果，且YES1过表达诱导的耐药可被EZH2抑制所阻断。这证明了YES1诱导的EZH2酪氨酸磷酸化在调控PARPi反应中起关键作用。

The translocation of phosphorylated EZH2 to mitochondria promotes mitochondrial fusion and inhibits mitochondrial apoptosis

机制探索发现，靶向磷酸化EZH2能显著增加PARPi诱导的细胞凋亡，并促进促凋亡蛋白BAX向线粒体易位。进一步观察发现，耐药细胞中线粒体呈现明显的融合状态，而抑制EZH2或YES1能逆转这种表型，诱导线粒体分裂。细胞分馏和免疫荧光实验证实，磷酸化的EZH2从细胞核易位至细胞质，并进一步在TOM20的帮助下定位到线粒体。基因集富集分析（GSEA）也显示，耐药细胞中“线粒体组织”和“蛋白质线粒体定位”相关基因显著富集。这些结果表明，磷酸化EZH2通过易位至线粒体、促进线粒体融合来抑制线粒体凋亡通路。

YES1 drives drug resistance by inducing the phosphorylation of EZH2 at tyrosine 728

研究人员通过生物信息学预测和点突变实验，确定Y728是YES1磷酸化EZH2的关键位点。模拟去磷酸化的Y728F突变体丧失了线粒体易位能力，无法恢复线粒体分裂，且能增强PARPi诱导的凋亡和体内抑瘤效果。而模拟磷酸化的Y728D突变体则表现出与野生型EZH2相似的促耐药功能。分子对接和体外磷酸化实验证实YES1^Y426D能特异性催化EZH2 Y728位点的磷酸化。临床样本检测显示，磷酸化的EZH2^pY728与活化的YES1^pY426水平呈正相关，且两者在PARPi耐药组织中均高表达。这证实Y728位点的磷酸化是EZH2功能转换和线粒体易位的关键分子开关。

Mitochondrion-localized EZH2 methylates MYO19 to enhance mitochondrial fusion

为了探明线粒体内EZH2的作用底物，研究人员进行了互作蛋白筛选，发现EZH2与线粒体锚定的肌球蛋白XIX（MYO19）结合增强。MYO19是一种调控细胞器动力学和氧化磷酸化代谢的蛋白质。功能实验表明，敲低MYO19能阻断EZH2抑制剂诱导的线粒体分裂和凋亡。EZH2并不调控MYO19的蛋白表达，而是通过催化其甲基化来影响其功能。进一步研究发现，MYO19蛋白上存在一个进化上保守的、类似组蛋白H3K27的EZH2识别基序（R-K-S），其中心的K928位点是甲基化位点。分子模拟显示，磷酸化的EZH2^Y728D能形成一个带负电的催化口袋，与带正电的MYO19-RKS基序结合。实验证实，EZH2^Y728D能特异性催化MYO19 K928位点的三甲基化。K928位点的去甲基化模拟突变体（K928R）能正常定位于线粒体、促进线粒体分裂、增强BAX线粒体易位和PARPi诱导的凋亡。这些结果证明，线粒体定位的磷酸化EZH2通过催化MYO19的K928位点三甲基化，阻止MYO19定位于线粒体，从而促进线粒体融合、抑制凋亡，最终导致PARPi耐药。

PARPi activates YES1 to increase EZH2 protein accumulation in PARPi-resistant EOC cells

研究发现，EZH2蛋白在耐药细胞和组织中高表达，但其mRNA水平无显著变化，表明调控发生在翻译后水平。PARPi处理能时间依赖性地增加敏感细胞中EZH2蛋白水平，而YES1抑制剂或达沙替尼（dasatinib）能阻断这种增加，并降低EZH2蛋白稳定性。机制上，PARPi处理能激活YES1，而YES1在耐药细胞中持续处于活化状态。这提示，PARPi诱导的YES1激活是导致EZH2蛋白积累的上游事件。

The phosphorylation of the Y728 residue of EZH2 prevents it from binding to the E3 ligase TRIM4 and increases its protein stability

为了阐明EZH2蛋白积累的机制，研究人员进行了蛋白质稳定性实验。结果显示，PARPi处理延长了EZH2蛋白的半衰期，而抑制其酪氨酸磷酸化则阻断此效应。泛素化实验表明，PARPi处理降低了EZH2的泛素化水平，YES1抑制剂能恢复其泛素化。进一步的筛选发现，E3泛素连接酶TRIM4与未磷酸化的EZH2特异性结合。在敏感细胞中，EZH2与TRIM4强结合；而在耐药细胞或PARPi处理后，两者的结合显著减弱。YES1抑制剂处理能恢复EZH2与TRIM4的结合。点突变实验证实，EZH2-Y728F突变体能与TRIM4结合并增加泛素化，而EZH2-Y728D突变体则破坏了这种相互作用。这表明，EZH2 Y728位点的磷酸化阻止了其与TRIM4的结合，减少了EZH2的泛素化降解，从而提高了其蛋白稳定性，导致其在细胞中累积。

结论与讨论

本研究系统性地揭示了BRCA1缺陷型上皮性卵巢癌（EOC）中PARP抑制剂（PARPi）获得性耐药的一个全新非经典机制。研究首次发现，长期PARPi治疗会激活酪氨酸激酶YES1，后者催化EZH2在Y728位点发生磷酸化。这一关键的翻译后修饰起到了双重作用：其一，它阻碍了EZH2与E3泛素连接酶TRIM4的结合，减少了EZH2的泛素化降解，导致磷酸化EZH2蛋白在细胞内异常累积；其二，它促使EZH2从细胞核易位至线粒体，这一过程依赖于线粒体外膜转位酶TOM20。在线粒体内，磷酸化的EZH2发挥其甲基转移酶活性，催化线粒体动力相关蛋白MYO19在K928位点发生三甲基化。MYO19的甲基化削弱了其与线粒体的结合，进而破坏了线粒体分裂/融合的动态平衡，导致线粒体网络倾向于融合状态。这种形态学改变抑制了促凋亡蛋白BAX向线粒体的易位和线粒体外膜透化（MOMP），最终阻断了内在凋亡通路的激活，使得肿瘤细胞在PARPi压力下得以存活。

这项研究的意义重大。首先，它阐明了一种不依赖于经典组蛋白修饰的、由EZH2驱动的PARPi耐药通路，拓展了我们对表观遗传调控因子在化疗耐药中“功能转换”的认识。其次，研究将线粒体动力学与表观遗传调控直接联系起来，揭示了细胞器功能重塑在获得性耐药中的核心作用。最重要的是，该研究提出了可行的治疗策略：靶向YES1-EZH2-MYO19轴。无论是使用已上市的YES1/ SRC家族激酶抑制剂（如达沙替尼），还是使用EZH2甲基转移酶抑制剂（如他泽司他），在临床前模型中都能有效逆转耐药、恢复肿瘤对PARPis的敏感性。这为临床上治疗对PARPi耐药的BRCA1缺陷型EOC患者提供了新的联合用药思路和精准治疗靶点。