《Environmental DNA》：Novel Assay for Endangered Hong Kong Grouper (Epinephelus akaara) to Assess eDNA Shedding, Decay, and Population Status
一种评估濒危香港石斑鱼eDNA释放、衰减及种群现状的新型检测方法
引言
海洋渔业在全球食物安全中扮演着至关重要的角色。然而，过度捕捞，特别是非法、不报告和不管制（IUU）的捕捞活动，严重威胁着渔业资源的可持续性。传统的鱼类种群评估方法，如拖网、刺网等，通常成本高昂、选择性低、副渔获物多，且对水生栖息地造成破坏，尤其不适用于种群数量稀少的濒危物种。
环境DNA（eDNA）分析技术为此提供了一种有前景的替代方案。该技术通过检测生物体释放到环境中的遗传物质（如粘液、粪便、组织等）来推断物种的存在。其中，靶向定量PCR（qPCR）提供了一种便捷、经济高效的分析手段，已被广泛应用于物种检测。然而，要将eDNA浓度准确地转化为生物量或丰度估计，必须了解目标物种eDNA的释放（产生）速率和衰减（持续）速率，这些参数通常具有物种特异性。
香港石斑鱼（Epinephelus akaara）是一种商业鱼类，在过去40年间，由于其分布范围内的过度开发，其种群数量下降了至少50%–80%，现已被世界自然保护联盟（IUCN）红色名录列为濒危（EN）物种。然而，关于其分布和栖息地利用的研究有限，导致缺乏针对性的物种管理策略。本研究的目标是：（1）开发一种探针法、物种特异性的高灵敏度qPCR检测方法，用于准确检测E. akaara的eDNA；（2）确定E. akaaraeDNA的释放和衰减速率，为未来的eDNA时空持续性模型提供支持；（3）将所开发的检测方法应用于香港海域的环境海水样本，以检测野生环境中E. akaara的时空信号。
方法
2.1 物种特异性检测方法的开发
为确保检测的高特异性，研究设计了一对扩增线粒体ND2基因71个碱基对（bp）区域的引物，以及一个内部水解探针。通过比对来自中国、日本和韩国的五个E. akaara线粒体基因组，构建了参考序列以考虑种内遗传变异。为确保对E. akaara的扩增特异性并排除共存的同属物种，从GenBank中检索了已知在南海北部与E. akaara共存的非目标物种的线粒体序列进行比较。结果显示，在正向引物、反向引物和探针结合区域，非目标同属物种平均分别有4.39±1.58、5.06±1.51和3.83±1.20个碱基对错配。对11种香港水域常见非目标海洋鱼类的线粒体序列分析也显示了大量错配，确保了引物和探针的特异性。
优化的qPCR反应体系包含TaqMan Gene Expression Master Mix、500 nM的两种引物、250 nM探针和2 μL基因组DNA，总体积20 μL。反应程序包括50°C孵育2分钟，95°C保持10分钟，随后进行40个循环的95°C 15秒和60°C 1分钟。特异性测试表明，该方法对包括近缘种（如E. awoara, E. fasciatomaculosus）在内的非目标物种、人类及宠物基因组DNA均无交叉扩增。
通过使用合成gBlock DNA片段的标准稀释曲线，采用曲线拟合法确定了该检测方法的检测限（LOD）和定量限（LOQ）。LOD定义为模板DNA产生至少95%阳性重复的最低浓度，LOQ定义为变异系数（CV）值低于35%的最低标准浓度。
2.2 封闭水族箱实验
实验在香港海洋公园公司的海洋研究设施中进行，以确定E. akaaraeDNA的释放和衰减速率。实验使用一个680 L的水箱，内部装有机械纤维过滤器，实验前用紫外线（UV）杀菌器循环一周以去除背景eDNA。实验前采集水样确认无E. akaaraeDNA信号。
两条成年E. akaara个体（重量分别为0.95 kg和0.90 kg）在实验前于独立系统中驯养超过一个月以减少应激。随后将它们转移至实验水箱中保持72小时以确定释放速率，期间禁食。在鱼放入后，于4.5、25.5、29、47.5、53.5、71小时采集水样计算eDNA释放速率。在将鱼移出后，于7.5、31、50.5、79小时进一步采集水样以确定衰减速率。
每次采样收集三个重复样本，每个样本为从水箱表面边缘采集的3 L水。水样立即通过0.45 μm聚醚砜（PES）滤膜过滤。所有过滤设备均用10%漂白剂灭菌。滤膜在液氮中运输并储存于-80°C直至eDNA提取。整个实验过程中，共处理了10个采样时间点的30个滤膜重复。实验期间，每2天过滤1 L Milli-Q水作为阴性对照。
eDNA提取使用DNeasy Blood & Tissue Kit，并进行了轻微修改。提取的DNA用Nanodrop分光光度计测定浓度和质量。
2.2.3 eDNA衰减速率建模
实验水箱被建模为完全混合的批次反应器，以确定E. akaaraeDNA的释放和衰减速率，遵循一阶衰减模型。衰减速率常数k通过在鱼移除后的衰减期内，对ln(C/C0)与时间（小时）进行线性回归拟合来计算，其中C0是稳态DNA浓度。在eDNA浓度达到稳态后（实验25.5小时后），浓度变化为零，因此释放速率S= kCV。释放速率以每小时的拷贝数和每公斤鱼生物量的拷贝数表示。eDNA半衰期（T1/2）通过公式T1/2= ln(2)/k计算。
2.3 采样点选择与野外eDNA采集
为了在海水环境中应用所开发的检测方法，研究在香港水域进行了时空尺度的水样采集。采样在四个时间点进行：2022年5月、8月、11月和2023年2月。根据以往的调查和渔民记录，E. akaara在香港主要分布于受南海海水影响较大的东部水域，栖息于沿海浅水珊瑚和砾石礁区。因此，选择了11个地点，包括历史记录点和禁止休闲及商业捕捞的当地海洋保护区。
每个地点沿2公里海岸线断面采集并过滤两个30 L海水的重复样本。海水通过蠕动泵在船上约1米水深处采集。每个重复样本首先通过10 μm线绕预过滤器以去除大颗粒物，然后通过0.45 μm 600 cm2PES滤膜过滤。每次采样还收集了蒸馏水的现场阴性对照。过滤后，每个滤膜用80 mL CTAB裂解缓冲液填充并在室温下保存。所有滤膜的DNA提取在采样后2周内完成。
野外样本的eDNA提取采用改进的低盐CTAB方案。提取的DNA用Nanodrop测定浓度和质量。使用针对叶绿体23S核糖体RNA基因的引物和探针（ePlant5）进行完整性测试，以评估样本质量和潜在的PCR抑制。所有样本的Cq值均低于30，表明提取的eDNA完整性足以进行后续分析，假阴性可能性低。使用本研究设计的引物和探针，每个滤膜进行5次qPCR技术重复，以检测目标物种eDNA。
结果
3.1 设计的检测方法性能
为E. akaara设计的物种特异性检测方法完全优化，扩增效率达到95.7%，标准曲线Y轴截距为39.6个循环。该方法的LOD和LOQ分别为每个反应3.71个拷贝和30个拷贝。在包括近缘种、人类及宠物基因组DNA在内的所有非目标样本中，40个qPCR循环内均未发现非特异性扩增。野外验证实验在所有qPCR重复中均产生阳性扩增，但所有扩增样本的每个反应eDNA拷贝数均低于LOD，eDNA浓度一致为14.6±0.694拷贝/升。
3.2 E. akaaraeDNA的释放速率和衰减速率
所有阴性对照（包括实验前样本、实验期间阴性对照和qPCR无模板对照）中均未检测到E. akaaraeDNA。两条E. akaara个体被引入实验水箱后，eDNA浓度迅速积累，在t= 4.5小时时即观察到高拷贝数。eDNA浓度在鱼移除前保持稳定，稳态浓度（25.5–71小时期间）计算为4.14×105±2.68×104（标准误）拷贝/升。鱼被移除后，eDNA浓度立即下降，在50.5小时后每个反应的拷贝数降至LOQ水平以下。
测得衰减速率常数为0.131±0.0111（标准误）/小时。据此计算，释放速率为每尾鱼每小时1.85×107±1.96×106（传播误差）拷贝，或按生物量计算为每克每小时1.94×104±2.07×103拷贝。eDNA半衰期（T1/2）为5.29小时。
3.3 环境海水样本中的eDNA检测
所有阴性对照（现场阴性对照、提取阴性对照和qPCR无模板对照）均无扩增。在空间和时间尺度上采集的绝大多数环境过滤海水样本中均未检测到E. akaaraeDNA。仅在88个样本中的6个（6.82%）检测到极微量的eDNA，且所有情况下浓度均低于LOD。计算得出的每个反应拷贝数在0.94–1.63之间。这些样本的检测概率也非常低，大多数情况下只有5次qPCR技术重复中的1次产生扩增。总体而言，仅在11个不同地点中的4个，在所有采样季节（2022年5月除外）检测到E. akaaraeDNA的微量痕迹。
讨论
4.1 E. akaara物种特异性eDNA检测方法的开发
为检测E. akaara而开发的eDNA检测方法，利用定制设计的引物对和内部水解探针，展示了高扩增效率、高灵敏度和高特异性。其扩增效率（95.7%）符合MIQE指南范围，LOD（每个反应3.71个拷贝）与其他鱼类eDNA检测方法相当，LOQ（每个反应30个拷贝）低于一些已建立的鱼类eDNA检测方法。特异性通过无近缘物种及共存同属物种的交叉扩增得到确认。该检测方法达到了Thalinger等人所建立框架下的4级验证水平，表明其准确性、单物种检测的灵敏度，并已准备好用于常规监测，结果可可靠地指示E. akaara的存在，且假阳性概率低。
4.2 E. akaaraeDNA释放速率和衰减速率
实验的第一个采样点（4.5小时）观察到E. akaaraeDNA浓度的最高峰值，这可能源于操作应激导致的额外eDNA释放。通过延长鱼的适应时间和eDNA在实验水箱中的积累，消除了这种额外输入的影响，使得浓度在鱼移除前达到稳态，从而能够计算释放和衰减速率。
本研究中E. akaaraeDNA的释放速率低于之前报道的其他海洋鱼类。E. akaara或石斑鱼属物种通常是独居和定居性的，大部分时间在底栖环境中度过，与活动性更强甚至群居的物种相比，其移动和能量利用有限。实验观察也发现E. akaara大部分时间静止于水箱底部且不活跃，这可能导致鱼类活动和能量利用较低，从而释放较少的eDNA。实验中也没有观察到明显的鳞片或粘液脱落迹象，这表明E. akaara身体物质脱落率低也可能是其释放速率较低的原因。此外，由于两条E. akaara个体在整个实验期间禁食且表现出静止行为，报告释放速率可能代表了成年E. akaara的下限。总之，该结果代表了成年E. akaara的物种特异性eDNA释放速率，并证明了确定目标物种释放速率的必要性，因为释放速率因物种、生理或行为特征以及生物量等多种因素而异。
E. akaaraeDNA的一阶衰减速率常数与之前研究中其他海洋鱼类报道的值相似。不同物种间衰减速率的一致性可能归因于细胞和自发降解过程，这些过程受eDNA分子状态和温度、pH、太阳辐射暴露等环境因素的影响，而非仅仅由物种本身决定。E. akaaraeDNA的半衰期估计为5.29小时，在鱼移除2天后浓度降至LOQ以下，表明大部分eDNA只能持续有限的时间尺度。这种短期持续性进一步表明eDNA是一种敏感的方法，可以提供能够自信地检测目标物种存在与否的当代快照，这与之前关于海洋环境中eDNA快速降解的研究一致。
本研究只使用了一个实验水箱系统，无法考虑不同系统设置之间可能存在的变异性，例如可能促进eDNA生物降解的微生物群落。也不能排除eDNA痕迹被截留在实验水箱的机械纤维过滤器中的可能性，这可能影响了整体结果。尽管如此，这项研究首次在受控实验系统中记录了Serranidae科物种E. akaara的释放和衰减速率，为了解eDNA的持续性以应用于监测提供了宝贵数据。未来的方向应侧重于解决生物量估计中因几何形态和代谢差异引起的问题，据报道，由于更高的总表面积与体积比以及代谢率，幼鱼比成鱼会释放更多的单位生物量eDNA，这可能导致对鱼类生物量的错误估计。未来的工作应考虑E. akaara的eDNA产生和降解如何与鱼类密度等生态因素以及温度、浊度和pH等环境参数协同变化。
4.3 检测方法在环境海水样本中的应用
本研究在空间和时间上进行了广泛的eDNA采样，覆盖了具有E. akaara历史分布记录的地点和栖息地，以及禁止休闲和商业捕捞的当地海洋保护区。尽管采样工作严密，但只有少数野外样本产生了qPCR扩增，eDNA浓度低于检测方法的LOD，且重复样本间的检测概率很低，表明采样环境中eDNA浓度极低。尽管如此，检测到这些微弱的eDNA信号对于E. akaara仍然至关重要，考虑到其低种群密度。此类微量检测可以为稀有或濒危物种的存在提供有价值的证据。本研究中，所有三个将低于LOD的检测归类为真阳性的标准均得到满足：在40个qPCR循环内扩增、一致的扩增曲线形态，以及阴性对照无扩增。这些发现支持将这些结果作为E. akaara存在的可靠定性证据，尽管eDNA浓度很低。
环境样本持续呈阴性结果表明，E. akaara在所调查区域要么不存在，要么数量非常稀少。这种稀有性得到了当地一项长达十年、超过7000人时的珊瑚礁鱼类水下视觉普查（UVC）数据集的支持，该数据集在2014年至2023年间观察到的E. akaara个体少于10尾。在广东等E. akaara渔业历史上盛行的南海区域附近的生物多样性调查中，eDNA宏条形码研究一致报告未检测到E. akaara。相比之下，在其分布范围内的其他地区，如东海、黄海和日本海，之前的eDNA宏条形码研究检测到了E. akaaraeDNA。这些发现得到了当地过去十年来主要在濑户内海和日本海放流人工培育的E. akaara幼鱼以维持其种群的努力的支持，同时多个县的渔获量数据显示，小规模的E. akaara渔业得以维持，年上岸量从几吨到40吨不等。eDNA和传统渔业调查数据一致显示，在E. akaara分布范围的北部信号更强，表明与南部相比，该区域的种群更为强健。eDNA与常规渔业调查方法之间的这种一致性，突显了eDNA作为一种监测和评估鱼类种群前景广阔的工具，而本研究设计的eDNA探针为在其整个分布范围内检测物种存在提供了一种标准化且有效的方法。
不能排除由于采样点E. akaara生物量低或数量有限而导致假阴性结果的可能性。之前的qPCR检测也未能检测到海洋环境中常规调查确认存在单个目标个体的稀有物种。这种失败可能源于水质化学、环境异质性、eDNA滞留的随机性以及大水体积或强水流造成的稀释效应等因素。在本研究中，野外验证实验产生了阳性qPCR扩增，但eDNA浓度很低（14.6±0.694拷贝/升）。这种低浓度可能源于所使用的E. akaara的低生物量和定居行为。类似于我们的中宇宙实验，野外观察也注意到石斑鱼在浮动网箱底部大部分时间不活动，这可能减少了eDNA的释放。两项实验都表明，石斑鱼的定居性使得在开放的海洋系统中检测稀有物种的eDNA变得复杂。总之，这些发现强调了在复杂、动态的海洋环境中使用eDNA检测稀有物种和解释阴性结果所面临的挑战。
采样方法中潜在的检测偏差值得考虑，特别是来自表层海水采样中目标eDNA垂直异质分布的可能性。然而，此前一项在2021年雨季（本研究前一年）进行的关于珊瑚礁鱼类群落的当地eDNA宏条形码研究观察到，表层和五米底栖深度之间的群落没有显著分化。具体来说，尽管该研究过滤的海水体积（3 L）比本研究小得多，但他们能够检测到许多与E. akaara相似的底栖定居和近底栖物种，表明调查区域的表层样本有效地反映了底栖物种多样性。结合本研究所使用的大过滤体积，我们认为已大大降低了这种检测偏差的可能性。
另一个可能混淆检测偏差的方法学挑战是不同eDNA提取方案之间提取效率的变异性。本研究中，我们使用基因组DNA比较了两种方法的提取效率，基因组DNA代表溶解的eDNA，即游离的、未与颗粒结合或包裹在细胞内的细胞外DNA状态。然而，eDNA以其他形式存在，包括膜结合eDNA和吸附eDNA。这些eDNA状态可能在影响检测概率方面发挥关键作用。膜结合和吸附eDNA通常不易降解，因为它们受到细胞膜或颗粒结合的保护性屏障，而溶解eDNA更容易受到微生物活性或化学分解等环境因素的影响。此外，eDNA状态表现出不同的沉降速度，例如吸附在较重颗粒上的eDNA可能比溶解eDNA下沉更快，影响它们在海洋环境中的分布和持续性，并最终改变它们在水样中的可检测性。没有单一方案能高效分离所有eDNA状态，因为它们的物理和化学特性需要量身定制的方法。例如，膜结合eDNA可能需要细胞裂解步骤，而吸附eDNA可能需要颗粒解离技术。这一限制可能影响目标物种的检测，因为每种eDNA状态在海洋环境中的普遍程度尚不清楚，而本研究中使用的提取方法未针对膜结合或吸附eDNA进行评估，也未评估它们之间的提取效率差异。未来的研究应量化研究区域E. akaara的溶解、膜结合和吸附eDNA的相对丰度、持续性和运输，并评估针对每种状态的提取方法的性能。
为了提高eDNA调查的可靠性并最大限度地减少假阴性结果，优化采样策略和分析方法至关重要。检测概率与qPCR技术重复次数密切相关，增加重复次数可以提高检测低丰度eDNA的可能性，尤其是在浓度低于每个反应1个拷贝时。此外，还应进行考虑占有率概率、检测概率和eDNA捕获概率的占有率建模，以提高数据的可靠性，因为它可以提供尽管是阴性结果但物种存在的概率。此外，占有率建模可以进一步纳入未来的数据分析，以测试检测概率如何随不同目标物种密度而变化，并进一步检查环境协变量对发生和检测概率的影响。
结论
总体而言，我们成功开发了一种用于检测濒危物种E. akaaraeDNA的可靠、物种特异性qPCR检测方法，具有高灵敏度和
