《Environmental DNA》：Development of eNA Sampling for Early Detection of Pathogens in On-Farm Water Sources
1 引言
病原体，包括病毒、细菌和能够引起宿主疾病的真核共生体，在生态系统功能中扮演着重要角色。然而，病原体也对人类、动物、植物和环境健康构成严重风险，如新型冠状病毒肺炎（COVID-19）大流行和高致病性禽流感（HPAI H5N1）的全球流行所示。在澳大利亚，口蹄疫（FMD）、牛结节性皮肤病（LSD）和非洲猪瘟（ASF）等高危病毒性牲畜疾病虽未发生，但仍是重大威胁。这些疾病的任何入侵都将对动物健康、福利、食品生产、贸易和国家经济产生深远影响。
早期检测、调查和监测对于降低此类风险、实现及时控制或根除工作至关重要。环境核酸（eNA）方法为传统监测提供了有前景的替代方案。eNA指的是生物体释放到环境中的遗传物质，包括DNA（eDNA）和RNA（eRNA）。相较于传统检测方法，eNA方法通常能提高检测灵敏度和效率。传统监测对于确定个体动物的感染状态和确认活动性疾病病例仍然至关重要，而eNA分析则在种群和环境层面提供了补充优势。它能独立于宿主采样检测病原体，捕获无症状个体的信号，并支持非侵入性、大范围的监测。将传统诊断与基于eNA的环境监测相结合，可为早期检测和生物安全准备提供一个全面且可扩展的框架。
病原体eNA已在多种自然和工程水生环境中成功检出。在水产养殖中，eNA已被有效用于监测一系列鱼类病原体。将eNA方法应用于陆地环境需要开发合适的采样方法。在农业中，已在生产用水源中检测到eDNA。在澳大利亚北部等大规模畜牧系统中，牲畜分布在大片土地上，使得个体采样具有挑战性。农场内的饮水点为eNA监测提供了一个实用的地点，因为动物会聚集在这些地方，并可能通过口腔或鼻腔分泌物排出DNA/RNA。因此，饮水槽为群体水平的监测提供了潜在的早期检测点。
结合eNA方法和行业及利益相关方参与，为可扩展、经济高效的监测提供了机会。此类参与式监测已成功应用于生物多样性评估，并在生物安全应用方面展现出前景。本研究的目标是：
- 1.
评估四种eNA采样方法（注射器过滤器、滤芯过滤器、被动过滤器、过滤漏斗）基于过滤水体积与核酸浓度关系捕获eNA的效率。
- 2.
评估每种采样方法在检测牲畜饮水槽中微生物（细菌）和病毒群落组成方面的性能。
- 3.
从易用性、检测性能和成本方面，为行业和土地所有者确定最合适的eNA采样套件。
2 材料与方法
2.1 研究地点与采样
研究地点位于澳大利亚北领地的查尔斯达尔文大学凯瑟琳乡村校区。水样于2023年11月从两个独立的围场（位点1和位点2）收集，每个围场包含一个由地下水直接独立供水的饮水槽，现场无其他水源。位点1（水牛围场）在采样前112天有50头婆罗门母牛及其牛犊持续使用水槽。位点2（萨比围场）在采样前22天有约57头6-8个月大、刚断奶的婆罗门小牛使用水槽。这两个位点在动物使用和环境暴露方面提供了对比条件，从而能够评估eNA回收效率，以及微生物和病毒载量的变化如何影响不同采样方法的核酸回收和群落组成。
2.2 病原体eNA收集
为评估eNA采样方法，测试并比较了四种eNA捕获类型：(a) 注射器过滤器, (b) 滤芯过滤器, (c) 带蠕动泵的过滤漏斗, (d) 被动过滤器。在每个位点，每种方法收集两个重复水样。成功过滤的水体积被记录。
2.2.1 注射器过滤器采样
注射器过滤器因其便携性和无需专业设备的易用性，常用于公民科学研究。文献综述确定了在澳大利亚可购买的合适注射器过滤器（0.22–1.2 μm）。选择了三种注射器过滤器材料：玻璃纤维和醋酸纤维素（GF+CA）、聚醚砜（PES）和醋酸纤维素（CA），孔径为0.22、0.45、0.8和1.2 μm，共六种注射器过滤器类型。为每种过滤器类型组装了采样套件。在每个位点，每种注射器过滤器类型收集两个独立的水样重复。每种注射器过滤器类型用于过滤水直至堵塞，记录注射器重新填充的次数。过滤后，将300 μL DNA/RNA保护剂直接添加到每个注射器过滤器中。过滤器密封后储存于冰上，运输回查尔斯达尔文大学痕量DNA实验室，在提取前于-20°C储存。
2.2.2 滤芯过滤器采样
滤芯过滤器可能比注射器过滤器处理更大的水体积。Sylphium eDNA双滤芯套件按照制造商说明使用。在每个位点，每种滤芯（0.22, 0.45 μm）收集两个独立的水样重复。过滤完成后，记录过滤的水量，添加提供的3.5 mL保护剂，密封后储存于冰上，运输后于-20°C储存。
2.2.3 过滤漏斗采样
过滤漏斗广泛用于传统的eDNA工作流程，需要更广泛的设备，通常在实验室而非现场使用。从每个位点收集2升水，运输到凯瑟琳乡村校区的现场住所。使用蠕动泵和孔径为0.45 μm的250 mL过滤漏斗过滤样品，记录每个重复过滤的体积。每个位点总共过滤两个水样。过滤器放入含有300 μL DNA/RNA保护剂的无菌DNA低结合管中，储存于冰上，运输后于-20°C冷冻。
2.2.4 被动过滤器采样
被动过滤越来越多地用于水生病原体检测，提供了一种低耗能、非机械化的替代方案。在每个位点的水槽中部署两个鱼雷式被动采样器，放置24小时。然后将四个采样器转移到冷室，用装有冰的保温箱运输到查尔斯达尔文大学，并于-20°C储存。在查尔斯达尔文大学，使用无菌镊子从每个被动采样器中取出过滤器，放入含有300 μL DNA/RNA保护剂的无菌管中。
2.3 病原体eNA提取
从每个注射器过滤器和滤芯过滤器中，将含有捕获生物材料的保护液转移到DNA低结合管中进行提取。对于被动采样器和过滤漏斗样品，在含有保留过滤器的300 μL DNA/RNA保护剂上进行提取。对于注射器过滤器、过滤漏斗和被动过滤器样品，一个重复使用Zymo Quick-DNA Miniprep Plus Kit提取，获得50 μL超纯总DNA。第二个重复使用Zymo Quick-DNA/RNA Viral Kit提取，回收50 μL高质量病毒DNA/RNA。在基于RNA的下游分析之前，将DNase 1应用于提取洗脱液以去除残留DNA。滤芯样品被排除在此分析之外，因为其提供的提取试剂盒针对DNA且不回收RNA。四个阴性现场对照与环境和用样品一起进行DNA提取，以检测采样过程中的潜在污染以及背景微生物和病毒DNA。对于八个滤芯样品，使用Sylphium eDNA提取试剂盒提取DNA。每次eNA提取批次中都包含一个阴性模板对照。
2.4 eNA细菌病原体分析—定量PCR
使用荧光法和分光光度法评估每个样品的环境核酸（eNA）质量和数量。使用Qubit荧光计测量样品浓度，使用NanoDrop分光光度计评估纯度。为评估细菌DNA的存在，对所有使用Zymo Quick-DNA Miniprep Plus Kit提取的样品应用了针对16S rRNA基因V4区的单一检测。使用来自地球微生物组计划的引物进行扩增。在Rotor-Gene Q实时PCR仪上进行定量PCR（qPCR）。每个20 μL qPCR反应包括：2× QuantiTect SYBR Green PCR预混液、各0.2 μM的引物、50 ng/μL牛血清白蛋白、8.5 μL无核酸酶水和1 μL模板DNA。样品以重复运行。包括六个阴性对照。每个qPCR运行中包含一个由纯培养的副溶血性弧菌基因组DNA组成的阳性对照，以验证试剂性能和扩增效率。环境样品的循环阈值用于作为细菌DNA丰度的相对指标。
2.5 eNA细菌病原体分析—宏条形码
对于16S rRNA基因测序，使用带有Illumina重叠接头序列、针对V3-V4高变区的引物进行PCR扩增。按照Illumina 16S宏基因组文库制备指南制备文库。在iSeq系统上对最终混合的等摩尔量扩增子文库进行测序。使用Illumina 16S宏基因组学工作流程过滤iSeq生成的原始读数。高质量序列被聚类，并制备了同一性为99.9%的操作分类单元。使用RefSeq RDP 16S v3数据库通过RDP分类器的高性能实现对序列进行物种分类。将测序数据稀疏化到最低样本深度，并从下游分析中排除少于10个读数的扩增序列变异特征。
2.6 eNA病毒病原体分析—全基因组测序
使用Qubit RNA高灵敏度检测试剂盒定量RNA浓度。质量控制分析包括评估RNA浓度、基于260:280和260:230吸光度比的纯度，以及RNA完整性指标。通过质量控制检测的样品在拉马乔蒂基因组学中心使用Illumina链特异性总RNA RiboZero Plus微生物组试剂盒准备进行测序。最终混合的文库在NovaSeq X Plus 10B平台上使用2×150 bp双端配置进行测序，每个样品产生约4000万对读数。使用FastQC评估原始Illumina读数数据的质量。使用Trimmomatic修剪双端读数。使用rnaSPAdes对高质量读数进行从头组装。使用ViralVerify筛选组装好的重叠群以确定病毒来源。随后使用Diamond将重叠群与RNA依赖性RNA聚合酶（RdRP）钻石数据库和NCBI非冗余（nr）数据库进行比对。在MEGAN6中使用基于RdRP和nr数据库的物种分类处理所得的DAA文件。本研究产生的原始测序数据可在NCBI序列读取档案中获取。病毒重叠群还与澳大利亚生物安全基因组数据库中的陆地动物病毒进行了交叉核对。
2.7 统计分析
我们分析了滤膜孔径、滤膜材料、过滤器类型和位点对过滤水体积、总DNA和RNA浓度以及细菌qPCR检测Ct值的影响。由于过滤体积和总DNA/RNA浓度呈非正态分布，因此应用了具有Gamma分布和对数链接函数的广义线性模型（GLM）。过滤体积被建模为滤膜孔径、滤膜材料、过滤器类型和位点的函数。对于总DNA和总RNA浓度，将滤膜孔径、滤膜材料、过滤器类型、体积和位点作为预测因子。所有分类变量（滤膜材料、过滤器类型、位点）被视为因子，而滤膜孔径和体积被视为连续变量。在建模前使用方差膨胀因子评估预测因子之间的共线性。基于Akaike信息准则进行模型选择。使用方差分析评估个体预测因子的显著性。
使用线性回归模型和Shapiro-Wilk正态性检验评估细菌Ct值在过滤器类型和孔径之间的差异。使用物种分配的读数计算细菌（属水平）和病毒（科水平）的α多样性指数，并使用Kruskal-Wallis检验在组间进行比较。使用Bray-Curtis相异度评估β多样性，并通过vegan包中的metaMDS函数使用非度量多维标度进行可视化。使用具有9999次置换的置换多元方差分析测试群落水平差异。所有统计分析均在R v3.9.4中进行。
3 结果
3.1 采样方法对体积和eNA浓度的影响
预测过滤水体积的最佳拟合广义线性模型包括滤膜孔径、过滤器类型、滤膜材料和位点作为预测因子。滤膜孔径对过滤体积的正向影响最强，表明孔径较大的过滤器显著增加了处理的水体积。过滤器类型也有影响，注射器过滤器产生的体积显著低于过滤漏斗。在滤膜材料中，CA显示出中等但显著的影响，而其他材料则不显著。位点是一个高度显著的预测因子，与位点1相比，在位点2观察到较低的过滤效率。方差分析结果支持过滤器类型、滤膜孔径和位点作为过滤体积最具影响力的预测因子的重要性。滤膜材料贡献了较小但仍具统计显著性的影响。
相比之下，预测总DNA浓度的最佳拟合广义线性模型包括过滤器类型、滤膜孔径和滤膜材料，而位点和过滤体积未保留在最终模型中。过滤器类型具有显著影响，注射器过滤器产生的DNA浓度低于过滤漏斗。尽管滤膜尺寸与DNA浓度呈正相关，但该关系不具有统计显著性。滤膜材料对DNA浓度没有显著的个体影响。然而，方差分析结果表明，过滤器类型和滤膜孔径都是DNA浓度的显著预测因子，而滤膜材料的影响较弱但显著。对于总RNA浓度，最终的广义线性模型确定滤膜材料CN具有中等但统计显著的影响。
3.2 不同捕获方法间细菌DNA扩增的比较
所有样品在16S rRNA基因qPCR检测中均成功扩增，而阴性对照中未检测到扩增。使用过滤漏斗和被动采样方法收集的样品观察到最低的Ct值，表明细菌eDNA浓度较高。Ct值的分布经Shapiro-Wilk检验确认为正态。Ct值并未随过滤水体积的变化而显著变化，表明采样方法而非处理体积对细菌eDNA检测效率有更大影响。
3.3 采样方法影响细菌和病毒群落多样性
eNA细菌病原体分析总共产生了4,682,754个FASTQ读数，并在所有采样方法中总共产生了2,341,377个16S rRNA细菌命中数和2,098,366个RNA-seq命中数。与使用其他过滤器类型的样品相比，使用滤芯过滤器收集的样品中细菌群落丰富度和香农多样性指数中等偏高。基于物种分类细菌属的Bray-Curtis相异度的非度量多维标度揭示了按位点明显不同的聚类，被动过滤器样品彼此间的聚类比与其各自位点的其他样品更紧密。这表明位点和采样方法都影响细菌群落组成。
使用nr和RdRP数据库对RNA-seq数据进行物种分类鉴定出23个病毒科，在不同样品中丰度各异。在位置1，病毒科丰富度在过滤器类型之间没有显著差异，但在位置2有中等显著性。在位置1，两个被动过滤器显示出最低的病毒科丰富度。病毒群落的香农多样性值在两个位点普遍较低。病毒群落组成受过滤器类型和总RNA浓度的显著影响。
最丰富的病毒科是拟态病毒科，分别占位点2和位点1所有病毒命中数的12.1%和10.2%。在我们的样品中检测到的几个病毒科，包括双RNA病毒科、冠状病毒科、正粘病毒科、泛布尼亚病毒科和呼肠孤病毒科，也列在澳大利亚陆地动物病毒生物安全基因组数据库中。此外，在所有样品的总细胞生物命中数中，分配给真核生物的RNA-seq命中数占43,893个重叠群，细菌占33,230个重叠群，古菌占1,503个重叠群。
3.4 成本比较
每种eNA采样方法（包括核酸提取）的估计每样品成本总结于表1。注射器过滤器套件最具成本效益，不同孔径和材料的每样品成本约为13-14美元。相比之下，其他采样方法，包括滤芯过滤器、过滤漏斗和被动过滤器，每样品成本均超过20.00美元。
4 讨论
本研究评估了四种eNA采样方法在检测牲畜饮水槽中细菌和病毒群落方面的适用性，并评估了它们在实际农场病原体监测中的适用性。所有采样方法都成功捕获了细菌和病毒eNA，实现了群落分析，证明饮水槽水可以作为畜牧系统中早期预警监测的有效环境储存库。我们已经证明，用于饮水槽水的eNA方法可以检测可能与疾病风险升高相关的病原体特征信号。基于成本、污染风险、过滤效率和群落丰富度等方法之间的关键差异，为它们在常规或有针对性的农场生物安全监测中的应用提供了重要考量。基于成本、易用性和封闭式设计，注射器过滤器最有可能在行业或利益相关方主导的监测中实施。然而，其他能够处理更大体积的方法可能会提高对低丰度病原体的检测。被动采样器捕获了独特的微生物谱，可以整合更长时间窗内的eNA信号，从而增加检测间歇性排放病原体的可能性。
滤膜孔径是过滤体积最重要的预测因子，较大的孔径显著提高了通量。增加过滤体积与病原体监测相关，因为过滤效率决定了处理的水量，从而决定了捕获低丰度病原体的概率。采样方法也显著影响过滤体积，注射器过滤器产生的体积低于过滤漏斗。这可能是由于更大的阻力、更小的表面积以及需要手动施压，我们在使用注射器过滤器过滤时观察到这一点变得越来越困难。位点特异性差异也很显著，与位点1较清澈的水相比，位点2过滤效率降低可能是由于水浊度和藻类存在。在浑浊条件下，孔径较大的过滤器表现更好。位点特异性差异表明，环境条件如浊度会限制过滤效率，在设计监测方案时应予以考虑。滤膜材料的影响较小，CA过滤器与增加的过滤体积相关。然而，这一结果也可能受到较大孔径的影响，因为这种材料用于孔径为0.8和1.2 μm的注射器过滤器。
相比之下，总DNA和RNA浓度受滤膜化学性质的影响比过滤体积更强。过滤器类型对DNA浓度有显著影响，注射器过滤器产生的DNA少于过滤漏斗。CN过滤器产生的RNA产量显著更高，表明滤膜材料选择可以增强病毒eNA回收，这是病毒病原体监测的关键因素。CN用于被动采样器和过滤漏斗方法。我们的结果表明，虽然过滤体积受物理和环境限制驱动，但DNA和RNA产量可能更依赖于滤膜材料化学性质和捕获效率。由于总DNA/RNA回收率并非主要由过滤体积驱动，这表明需要考虑滤膜化学性质和处理，而非仅追求最大通量。
虽然总DNA浓度常被用作eNA捕获效率的指标，但它并不总是反映目标生物的丰度。基于qPCR的定量为方法性能提供了更具体和功能性的评估。在我们的研究中，总DNA浓度与细菌qPCR扩增密切相关。虽然我们的qPCR针对的是一般细菌16S rRNA序列而非特定病原体，但这种关系表明，像滤芯那样能最大化DNA产量的方法将增强下游针对病原体的检测。
群落多样性分析表明，使用滤芯收集的样品中细菌丰富度和香农多样性指数中等偏高，细菌群落组成因位点而异。非度量多维标度排序表明，被动过滤器重复彼此间比同一地点的其他方法更为相似，表明方法依赖性的群落捕获。病毒群落分析检测到23个病毒科，包括列在澳大利亚生物安全基因组数据库中的双RNA病毒科、冠状病毒科、正粘病毒科、泛布尼亚病毒科和呼肠孤病毒科。拟态病毒科是跨两个位点最丰富的病毒科。虽然科水平的分类不能诊断疾病，但它们提供了重要的早期预警，可以触发对特定关注病原体的针对性qPCR检测。我们的RNA-seq结果检测到所有三个细胞生命域的序列，证明了eNA在环境样品中对病毒、真核生物、微生物和古菌病原体进行广泛监测的潜力。
从最终用户的角度来看，实际考量因素区分了这四种采样方法。注射器过滤器最具成本效益，封闭且易于部署，设备要求最低，适合频繁或大规模的监测。虽然过滤漏斗处理了更大的体积并捕获了更多的DNA，但它们需要开放操作和更长的过滤时间，这增加了污染风险，因此更适合受控或实验室环境。被动过滤器所需设备最少，可能检测到时间信号，非常适合远程部署。然而，依赖冷链运输限制了现场的实用性。滤芯作为注射器过滤器的替代品也很有前景，尽管成本更高，因为它们具有最高的丰富度
