《Environmental Microbiology》：Discovering PETases: An Interlink Between Engineering Enzymes and Microbiomes
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这篇综述探讨了连接微生物生态学与酶工程的PET水解酶（PETase）发现新范式。文章指出，超越传统同源搜索，通过扰动微生物组（如添加PET类似物）、结合宏基因组学和人工智能（AI）进行3D结构与功能预测，是挖掘新型嗜热、嗜盐、耐酸PETase的有效途径，旨在为工业级PET生物催化提供更优的酶骨架。
发现PET水解酶：连接微生物组重塑与酶工程的新前沿
引言
聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）是一种丰富的合成聚酯，也是目前唯一在工业规模上实现酶法回收的塑料。过去几十年，研究重点集中在筛选和改造PET降解水解酶（PETase），以期找到能在环境和工业条件下高效运作的酶变体。然而，使用已知的PETase作为参考进行宏基因组同源性搜索，限制了新酶的发现范围，使得序列图谱变得狭窄。目前，工业PET生物催化仍迫切需要找到高效的嗜热、耐盐和pH耐受性强的PETase。PETase的成功工程化，某种程度上导致人们低估了环境微生物组作为新型高效酶来源的潜力。本综述提出了一种结合靶向生态系统挖掘、微生物组重塑、基因中心宏基因组学和人工智能（AI）辅助分析的概念框架，旨在超越已知PETase家族，拓展序列/结构空间。
合适的PET活性酶微生物来源
过去二十年间，多项研究和宏基因组调查致力于在不同自然生态系统中识别PET活性酶。例如，工程化酶LCCICCG的野生型版本最初就是从叶枝堆肥的宏基因组中获得的。有研究表明，陆地微生物组中推定的PETase出现频率更高，其降解聚酯的潜力也比海洋微生物组更为广泛。在分类学上观察到一种明显的模式：来自放线菌门（Actinobacteriota）的预测PETase在陆地生态系统中更常见，而来自变形菌门（Pseudomonadota）和拟杆菌门（Bacteroidota）的推定PETase则频繁出现在海洋环境中。
近期研究表明，盐假单胞菌属（Halopseudomonas）是海洋来源微生物组中嗜盐PETase的主要微生物来源。然而，海杆菌属（Marinobacter）、弧菌属（Vibrio）、诺卡氏菌属（Nocardioides）和酮杆菌属（Ketobacter）等也被确定为海洋生态系统中新型PETase的替代来源。此外，深海生态系统（如热液喷口）作为微塑料的汇集地，似乎是耐盐和耐热PETase的一个有前景的来源。例如，一个特征明确的PET活性酶（阿魏酸酯酶PET46）就在古菌（Archaea）域中被发现，它来自瓜伊马斯盆地热液沉积物的宏基因组组装基因组。
陆地微生物组中预测PETase的高普遍性，可能与含有与PET相同酯键的植物聚合物（如角质、木栓质和富含木聚糖的底物）的持续输入有关。因此，含有PET类似天然聚酯的陆地生态系统非常适合寻找PET活性类群和酶。此外，含有大量有机物和塑料输入的人造系统也被报道是塑料降解酶的来源。红树林土壤是寻找细菌和古菌嗜盐PETase的理想生态系统，因为其相关微生物组具有复杂的多样性，并且持续暴露于植物聚合物和塑料污染之下。
重塑环境微生物组以揭示新型PET降解能力
预测性PETase被认为是稀有酶，因为它们在环境微生物组中的出现频率非常低。因此，通过微观世界或富集培养人工且可控地重塑环境微生物组，有可能增加识别新型PETase的可能性。换句话说，通过改变环境微生物组的结构，可以破坏现有的微生物层级，从而选择具有潜在PET解聚能力的目标或稀有种群。
最近，有研究设计了添加了PET微粒的深海沉积物静态微观世界实验，以及添加了PET薄膜的红树林沉积物实验，作为选择和富集PET降解原核物种的一种方法。虽然在选择过程中使用无定形PET是一种合理的策略，但向土壤或沉积物微观世界中加入天然的PET类似底物或植物生物质，可以极大地重塑其微生物群落，从而富集潜在的PET解聚类群和酶。例如，我们团队最近的一项研究报道，向红树林土壤微观世界添加稻壳，增加了相应宏基因组中推定的嗜盐PETase的出现频率，其中一些酶与海杆菌属和微泡菌属相关。
最近的研究表明，与单一微生物相比，微生物群落转化PET及其单体的效率更高。这是因为在聚酯降解微生物群落中，专家和通才的存在、酶协同作用和分工是常见的。为了评估PET降解效率，人们组装了一些合成微生物群落，其中假单胞菌属和芽孢杆菌属成为这些PET降解合成群落的关键成员。此外，通过液体富集培养选择PET转化微生物群落，有可能有助于阐明与PET降解相关的生态学和酶学，也为改进发现参与这一代谢过程的新型类群和酶提供了途径。
在选择具有PET降解能力的微生物群落时，可以使用不同的底物作为唯一的碳源，例如PET纳米颗粒、天然富含聚酯的底物或木质纤维素。使用PET纳米颗粒可能有利于微生物生长，因为与块状PET相比，其具有更高的表面积体积比和更低的分子量。此外，从已预先适应天然富含聚酯底物的微生物群落开始，可能会增加在液体富集培养中选择推定PET降解类群和酶的几率。这一假设基于在筛选木质纤维素降解群落时报道的历史偶然性或遗留效应。在木质纤维素上生长的微生物群落有潜力成为PETase的来源。例如，从一个安第斯土壤来源的木质纤维素分解微生物群落中，在20个基因组中检测到27个预测PETase。
宏基因组中预测性PET降解酶的筛选与排序
宏基因组可以从多个维度进行分析。然而，为了最大限度地减少信息丢失并最大化候选物的回收率，将读段组装成重叠群，然后开发完整的基因目录，是从宏基因组中进行PETase生物勘探的最佳方法。自从LCC和IsPETase被发现以来，多项研究专注于探索宏基因组以筛选PETase。目前的方法基于序列相似性，包括针对特定数据库中已知PET活性酶的多重序列比对或隐马尔可夫模型搜索。HMM搜索似乎更敏感，而BLAST可能会产生假阳性结果，检测到对PET具有低活性或无活性的α/β-折叠水解酶。因此，建议使用不同的序列同源性阈值，以识别与已知PET活性酶具有中等（≥50%同一性和≥80%覆盖率）到高度（≥70%同一性和≥90%覆盖率）相似性的酶。
最近，有报道在扩展的公共全球组装体中进行基于相似性的预测PET活性酶搜索，产生了约2.15亿个非冗余的PAZy同源物。这些序列可在PETadex数据集中公开获取。另一种在基因目录中识别PETase的策略是搜索特定的蛋白质特征。例如，功能性M5基序已被用于识别来自海洋宏基因组的目录中的PETase和假PETase。然而，这种策略是有限的，因为几种新型PET活性酶缺乏这个基序。一种结合蛋白质网络分析和酶活性测定来检测和排序聚酯酶-脂肪酶-角质酶家族中PETase的有趣方法最近被使用。然而，仍然需要创新的计算流程，例如使用3D结构特征在宏基因组中筛选潜在的PETase。因此，必须对不同基于相似性的搜索结果进行比较以获得共识，并且需要辅以3D结构分析和分子对接，以检测催化区域、二硫键位点、特定结构构象以及参与PET转换的关键残基。随着新的基于AI的工具和用于分类的蛋白质嵌入的实现，这一领域正在取得进展。
机器学习框架已被设计用于预测酶降解塑料的能力，并用于在公共蛋白质数据集中识别塑料降解酶。此外，一个有趣的基于机器学习的方法被实施，用于在垃圾填埋场的全球宏基因组收集中识别推定的塑料降解酶。最近，Mican等人提出了一个用于发现、富集、过滤、排序和优化候选PETase的计算工作流程，但已知PET活性酶的基因组背景仍未在该工作流程中考虑，且目前仍未得到充分探索。这些信息可能有助于指导新型PETase的挖掘。此外，3D蛋白质结构、动力学参数、最佳条件、溶解度和熔化温度可以使用基于AI的集成流程进行预测。这种多方面的分析产生了一个可靠的PETase排序，加速了发现过程，并有助于检测出最有前途的候选物，用于进一步的活性测试或蛋白质工程试验。预计，使用量子计算方法可以加速PETase的发现和工程化。
PET酶法转化的未来与展望
在不同生态系统和微生物谱系中寻找PET活性酶是一个热门话题。然而，古菌门仍未得到充分探索；它可能蕴藏着多种在多种极端条件下具有活性的PETase。迄今为止，仅报道了四种具有古菌来源的PET活性酶。其他极端微生物，如从沙漠土壤中分离的耐辐射奇球菌，已被证明是新型聚酯酶（对PET具有活性，且与LCCICCG相当）的来源。正如引言中提到的，一个新的细菌PETase类群已经被报道，预计未来几年将会有其他家族被描述。其中许多可能采用非经典的3D折叠，具有不同的3D蛋白质结构。因此，建议探索α/β-折叠之外的结构折叠，用于PET等非天然底物。就催化特性而言，从自然生态系统中挖掘PETase可能比改造它们更成功，正如其他α/β-折叠酶类所报道的那样。
全球许多研究人员正在寻找超越LCC及其变体效率的新型PETase。近年来，来自不同PETase家族的蛋白质已被改造以提高其高温下的活性。此外，最近还创建了旨在改进已知PETase骨架活性的竞赛，以期找到更高效的基准变体。新的基于AI的方法在现有PETase新变体的设计中将变得更加重要。此外，预计酶法PET解聚的未来在于从头创建具有改进特性的最小蛋白质骨架。在工业环境中，在PET解聚过程中设计、测试和使用酶鸡尾酒既有优势也有劣势。例如，使用不同PETase变体的混合物或双酶系统可以增加解聚速率，减少由于PET低聚物引起的酶抑制效应，并促进PET衍生单体的释放。然而，预计在扩大规模的情况下，使用酶鸡尾酒将增加运营成本。此外，提倡并需要使用替代蛋白质来促进结晶PET的解聚。为了实现这一目标，裂解性多糖单加氧酶和疏水蛋白是能够结合PET、改变其亲水性并促进后续酶活性的合适候选物。
除了聚酯的酶法转化，全细胞系统已被开发用于转化PET。例如，能够代谢PET单体的微生物已被改造以分泌高效的PETase。此外，一种广宿主范围的接合质粒已被用于转化废水来源的微生物物种，使其能够在特定条件下产生PETase。另外，一种称为GenRewire的创新策略已被开发，旨在通过重新布线和基因组编辑，在不引入外源DNA的情况下，生产具有PET降解能力的微生物物种。这种方法可以彻底改变工业和自然生物修复场景中的塑料催化。然而，最终，高效的PET转化和新型酶技术的发展将需要微生物学家、计算生物学家、聚合物科学家和酶学家之间的密切合作。
结论
目前，用于在环境微生物组中筛选PETase的序列同源性策略由于数据库中已知PETase的参考而存在偏差。因此，潜在新型PETase的检测受到限制，因为搜索仅限于那些与已知特征PETase具有中等到高度序列相似性的酶。在回顾了近期文献后，我们提出，探索陆地生态系统，结合使用天然富含聚酯的底物扰动微生物组，以及创新的搜索策略，包括基于AI的方法和3D蛋白质结构的整合，将增强新型推定PETase的发现。这种探索形式还应与结构分析、酶学特性预测和高通量PET酶活性评估相结合。虽然蛋白质工程可以产生适用于工业应用的改良变体，但微生物组工程策略有潜力揭示具有PET降解能力的新型类群和酶。此外，这些策略还可以提供关于自然环境中PET转化相关的生态酶学的见解。目前，在开发用于工业酶法回收的最有效工程化PETase方面存在激烈竞争。然而，这一过程需要考虑几个挑战，包括PET的结晶度、下游加工和经济可行性。大自然很可能能提供更优的PETase，但需要创新的策略在复杂的微生物物种“丛林”中识别它们。在某些酶类中，自然来源的骨架胜过大量工程化的变体，这表明挖掘天然微生物多样性有时可能超越详尽的酶工程改造。新的方法、策略和技术正在不断被开发，但推动PET的生物催化需要科学家、公司、机构和政府之间的合作，其动力来源于隐藏在环境微生物组中的巨大多样性和功能。
