《Environmental Microbiology Reports》：Differential Analysis of IAA Anabolism Pathway Based on Bacillus cereus, Bacillus subtilis and Bacillus safensis Genome
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本研究报告对三种分离自太行山侧柏根际的芽孢杆菌菌株（蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、沙福芽孢杆菌）进行了比较基因组学和生化特性分析，首次系统性阐明了它们在生长素（IAA）合成代谢通路（TAM、IAM、IPyA）上的差异，为挖掘高产IAA的高品质微生物菌剂菌种资源和理解植物促生机制提供了重要的理论基础。
1 前言
作为根际促生菌的核心功能类群，芽孢杆菌在根际微生态系统中具有不可替代的生态位价值。大多数芽孢杆菌属的菌种能够在营养丰富的纯培养体系中保持营养体状态，并具备吲哚类物质的生物合成能力。吲哚-3-乙酸是植物体内主要的生长素，在植物生长发育过程中扮演着重要的调控角色。它能影响植物细胞的伸长与分裂、主根和侧根及下胚轴的生长、维管组织的发育以及根毛和花器官的形成，对植物的生长发育具有重要意义。
当前，关于芽孢杆菌产生IAA的研究正在前沿理论与技术方法上实现双重突破。除了高效的IAA合成能力，这些菌株还展现出溶磷、释钾、产铁载体及耐逆性等多种促生特性，为微生物菌剂的开发提供了优质的种质资源。芽孢杆菌属菌种主要通过色氨酸依赖途径在体内合成和代谢IAA。通过分子生物学及多组学技术手段，已初步分析了IAA合成代谢通路中部分关键基因的调控作用，色氨酸依赖途径的分子机制正逐步明晰。芽孢杆菌合成和代谢IAA的能力已被广泛应用于微生物肥料、种子处理剂、堆肥接种剂等的研制中，并在促进植物根系发育、提高作物产量和改良土壤肥力方面显示出显著效果。
尽管如此，本领域仍缺乏对芽孢杆菌IAA合成代谢途径的系统性分析。因此，本实验对蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和沙福芽孢杆菌这三株芽孢杆菌属菌株进行了全基因组测序和靶向代谢组学分析，旨在深入探究这些菌株的IAA合成代谢通路，揭示其应用的分子基础，为芽孢杆菌IAA合成代谢的实际应用提供理论依据，同时为制备多功能、高产IAA的芽孢杆菌菌剂提供技术支持，从而为植物促生菌的开发与应用奠定重要基础。
2 结果
2.1 蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和沙福芽孢杆菌的形态特征
研究人员从太行山侧柏根际土壤中采集样品，经过梯度稀释涂布于LB固体培养基。在37°C下培养24小时后，通过划线平板法对单菌落进行纯化。结合革兰氏染色和菌落表型筛选，获得了三株推测的芽孢杆菌分离株。通过扫描电子显微镜观察细胞形态，初步鉴定为杆状细菌。随后的全基因组测序分析确认这三株菌分别为蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和沙福芽孢杆菌。
显微观察结果显示，蜡样芽孢杆菌呈杆状，细胞末端平齐，直径为1.0–1.2 μm，长度为3.0–5.0 μm。枯草芽孢杆菌同样呈杆状，但末端圆润，尺寸为直径1.0–1.2 μm，长度3.0–5.0 μm。沙福芽孢杆菌的特征为杆状，直径0.4–0.6 μm，长度1.5–3.7 μm。
2.2 蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和沙福芽孢杆菌菌株的功能检测
通过Salkowski比色法鉴定三株菌的吲哚合成代谢能力。结果显示，三株菌均具有产吲哚能力。检测了三株菌液体培养基中的吲哚含量。当枯草芽孢杆菌培养36小时时，液体培养基中的吲哚含量达到最大值，随后随培养时间延长呈下降趋势。蜡样芽孢杆菌和沙福芽孢杆菌的吲哚合成代谢速率慢于枯草芽孢杆菌，其液体培养基中的吲哚含量在培养42小时时达到最大值。
研究人员还检测了三株菌的产铁载体、溶磷、释钾、产蛋白酶、耐盐和耐碱能力。结果显示：沙福芽孢杆菌菌株具有产铁载体能力；三株菌均不具备溶磷能力；蜡样芽孢杆菌和沙福芽孢杆菌菌株具有释钾能力；蜡样芽孢杆菌和沙福芽孢杆菌具有产蛋白酶能力，其中沙福芽孢杆菌能力更强。此外，三株菌均表现出耐盐性，其中沙福芽孢杆菌在高盐浓度下生长最高。在初始pH为9的LB固体培养基中培养时，三株菌均表现出耐碱性：蜡样芽孢杆菌和沙福芽孢杆菌的OD600值超过0.200，其中蜡样芽孢杆菌的OD600值达到0.625，且培养基的pH在培养过程中从9降至6.72。革兰氏染色结果证实三株菌均为革兰氏阳性。
2.3 细菌基因组基本特征与CRISPR-Cas预测
对蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和沙福芽孢杆菌菌株进行了全基因组测序。从测序结果可见，蜡样芽孢杆菌菌株的基因组大小和编码基因总长度最长，分别为5,786,006 bp和4,798,041 bp；枯草芽孢杆菌菌株的GC含量最高，为43.54%，平均基因长度最长，为8107 bp。利用CRTv1.2软件预测了三株菌中的CRISPR。结果显示，在蜡样芽孢杆菌基因组中共预测到4个CRISPR-Cas系统；在枯草芽孢杆菌基因组中共预测到9个CRISPR-Cas系统；在沙福芽孢杆菌基因组中共预测到10个CRISPR-Cas系统。
2.4 基因组岛预测
在蜡样芽孢杆菌的基因组中，预测了4个基因组岛，总长度为45,007 bp，平均长度为11,251.75 bp；在枯草芽孢杆菌的基因组中，共预测了5个基因组岛，总长度为246,440 bp，平均长度为49,288 bp；在沙福芽孢杆菌的基因组中预测了8个基因组岛，总长度为95,379 bp，平均长度为11,922.375 bp。
2.5 细菌基因组KEGG注释
从蜡样芽孢杆菌基因组中预测了5708个基因，其中2491个基因基于京都基因与基因组百科全书数据库被注释了功能信息，占预测基因总数的43.65%。根据KEGG注释结果，53.85%的注释基因与代谢相关，10.47%与环境信息处理相关，8.47%与遗传信息处理相关，2.32%与细胞过程相关。对于枯草芽孢杆菌，从其基因组中预测了4222个基因，其中2303个基因被成功注释，占总数的54.54%。在这些注释基因中，52.71%与代谢相关，13.06%与环境信息处理相关，7.16%与遗传信息处理相关，3.82%与细胞过程相关。对于沙福芽孢杆菌，从其基因组中预测了3467个基因，其中2086个基因被功能注释，占预测基因总数的57.19%。KEGG注释显示，53.21%的注释基因参与代谢，13.42%参与环境信息处理，6.47%参与遗传信息处理，2.73%参与细胞过程。
2.6 基于全基因组测序与注释的色氨酸代谢通路分析
为分析蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和沙福芽孢杆菌中的色氨酸代谢通路，研究人员选取了IAA生物合成关键酶的同源序列，对这三株菌的基因组数据进行BLAST搜索，旨在鉴定与IAA合成代谢相关的基因。结果显示，在蜡样芽孢杆菌中总共注释了7个参与生长素合成的基因；在枯草芽孢杆菌中总共注释了5个参与生长素合成的差异基因；在沙福芽孢杆菌中总共注释了3个参与生长素合成的差异基因。
2.7 采用UPLC–MS法测定发酵液中的吲哚类化合物
吲哚-3-乙酰胺、吲哚-3-丙酮酸、吲哚-3-乙腈、色胺、吲哚-3-乙醇、吲哚-3-乳酸和吲哚-3-乙醛是色氨酸依赖的IAA合成代谢途径的中间产物。其中，吲哚-3-乙醛化学性质不稳定，在一定条件下可转化为吲哚-3-乙醇；吲哚-3-丙酮酸在一定条件下可转化为吲哚-3-乙酰胺。
研究人员在蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和沙福芽孢杆菌的菌泥和发酵液中总共检测到31种吲哚衍生物。其中，在蜡样芽孢杆菌的菌泥和发酵液中均检测到22种吲哚衍生物；在枯草芽孢杆菌的菌泥中检测到17种，在其发酵液中检测到19种；在沙福芽孢杆菌的菌泥中检测到18种，在其发酵液中检测到19种。
2.8 IAA合成代谢通路
基于BLAST分析和吲哚衍生物的检测，研究人员分析了蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和沙福芽孢杆菌的IAA合成代谢通路。推测蜡样芽孢杆菌中存在三种IAA合成代谢通路，即TAM、IAM和IPyA。在TAM通路中，单胺氧化酶催化色胺的氧化反应；在IAM通路中，酰胺酶参与吲哚乙酰胺的水解过程；在IPyA通路中，醛脱氢酶催化吲哚乙醛的氧化反应。相比之下，枯草芽孢杆菌通过酰胺酶和醛脱氢酶参与IAM和IPyA通路的代谢活动，而沙福芽孢杆菌主要依靠色氨酸氨基转移酶、吲哚丙酮酸脱羧酶和醛脱氢酶构建IPyA通路。
研究人员在蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和沙福芽孢杆菌的基因组中标出了参与IAA合成代谢通路的关键基因位置。
3 讨论
芽孢杆菌属中的许多细菌可以促进植物生长。色氨酸依赖途径是IAA合成的主要生物合成途径之一，而色氨酸依赖途径的关键基因是调控IAA合成代谢的核心因子。IAA作为植物生长发育的核心调控因子，广泛参与植物的胁迫响应、生长周期调控及生理生化过程。值得注意的是，IAA的合成不仅发生在植物体内，也可由与其共生的微生物完成。植物根系能产生色胺等生长素前体物质，这些前体物质可作为细菌IAA合成代谢的底物，支持微生物通过色氨酸途径生成IAA。植物根系与微生物之间的这种底物-产物交换，构建了一个“植物合成前体—微生物转化为IAA—植物利用IAA”的代谢循环，加强了植物与微生物在生长素合成和信号调控方面的协同关系，促进了植物生长和胁迫适应能力的提升。
对蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和沙福芽孢杆菌进行的生化测试发现，蜡样芽孢杆菌和沙福芽孢杆菌菌株具有一定的耐盐性和合成代谢吲哚的能力。其中，沙福芽孢杆菌菌株的耐盐性显著高于另外两株菌，而蜡样芽孢杆菌菌株的耐碱性显著高于另外两株菌。通过设置时间进程检测菌株发酵液发现，三株菌产吲哚的能力在72小时内均呈现先升高后降低的趋势，表明这些细菌都拥有IAA合成的相关基因和代谢通路。在细菌对数生长期，营养充足、环境条件适宜时，这些基因被激活表达，相应的酶催化吲哚合成，导致其在细菌细胞内含量逐渐升高。推测随着细胞分泌到胞外的吲哚积累到一定浓度，可能触发反馈调节机制。吲哚可能抑制合成途径关键酶的活性或抑制相关基因的表达，从而减少吲哚合成。细菌也可能激活分解代谢途径，将过量的吲哚分解为其他代谢产物，导致其含量下降。
除了上述代谢调控机制，细菌还拥有独特的适应性免疫防御机制——CRISPR-Cas系统，该系统在抵抗噬菌体及外源质粒入侵方面具有重要作用。本研究中预测蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和沙福芽孢杆菌的基因组中分别含有4、9和10个CRISPR-Cas系统。基因组岛是近缘菌株间离散的DNA片段，目前认为其形成有助于微生物的多样化和适应。通过分析基因组GC含量、tRNA位点等特征，预测了多个可能的基因组岛区域。在蜡样芽孢杆菌基因组中预测了4个基因组岛；在枯草芽孢杆菌基因组中预测了5个；在沙福芽孢杆菌基因组中预测了8个。不同芽孢杆菌物种间基因组岛数量的差异，可能反映了它们在长期进化过程中形成的独特适应策略。
目前，细菌IAA合成代谢的主要通路已经明确。它们通过吲哚丙酮酸、吲哚乙酰胺或吲哚乙腈等中间体，从色氨酸的α-碳上移除氨基和羧基，并通常将氧化的终产物作为IAA分泌出来。研究人员在蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和沙福芽孢杆菌的基因组中检索了色氨酸依赖途径的关键基因，并分析了菌株发酵液中的代谢物。发现蜡样芽孢杆菌基因组注释了iaaM、ami、tat、ipd、aldh、tdc和mao基因。在发酵液中检测到色胺、吲哚-3-乙酰胺和吲哚-3-乙醇。基于关键基因组成和代谢物，推测蜡样芽孢杆菌菌株可能含有TAM通路、IAM通路和IPyA通路。枯草芽孢杆菌基因组注释了iaaM、ami、tat、ipd和aldh基因，但未检测到tdc和mao基因。在发酵液中检测到色胺、吲哚-3-乙酰胺和吲哚-3-乙醇，表明枯草芽孢杆菌菌株可能仅包含IAM通路和IPyA通路。沙福芽孢杆菌基因组注释了tat、ipd和aldh基因，但未检测到iaaM、ami、tdc和mao基因。在发酵液中检测到色胺、吲哚-3-乙酰胺和吲哚-3-乙醇，表明沙福芽孢杆菌菌株可能仅包含IPyA通路。
研究发现，枯草芽孢杆菌在吲哚的合成代谢中效率最高。比较枯草芽孢杆菌和沙福芽孢杆菌的IAA合成代谢通路，发现枯草芽孢杆菌拥有沙福芽孢杆菌所缺乏的IAM通路。推测能够通过两步催化反应合成IAA的IAM通路，比需要三步催化反应产生IAA的IPyA通路更快。基于此，推断蜡样芽孢杆菌中的IAM通路在IAA合成代谢中效率最高；比较枯草芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌的IAA合成代谢通路，发现蜡样芽孢杆菌同样拥有IAM通路。然而，其IAA合成代谢效率却不如枯草芽孢杆菌。推测蜡样芽孢杆菌通过TAM通路和IPyA通路合成代谢IAA。
植物根系分泌出色胺等生长素前体物质，为根际微生物的代谢活动提供了重要底物。蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和沙福芽孢杆菌能够利用植物根系释放的色胺等前体物质合成IAA。这一过程构建了“植物合成前体—微生物转化为IAA—植物利用IAA”的代谢循环，实现了植物与微生物间的物质循环和能量流动。当这些芽孢杆菌菌株通过定殖在植物根部周围进行应用时，它们合成代谢的IAA将有效满足植物生长对激素的需求。这不仅增强了根系吸收水分和养分的能力，还调节了植物生长发育进程，提高了植物的抗逆性，从而增加植物产量和品质，为农业可持续发展提供有力的微生物资源。
4 方法
4.1 菌株的采样、分离与筛选
样品采集自太行山侧柏根际土壤。将样品置于含无菌蒸馏水的锥形瓶中振荡，随后对样品悬浮液进行梯度稀释，并涂布于灭菌的LB固体培养基上。平板在30°C培养，挑取单菌落进行传代培养以供后续分析。菌株在LB液体培养基中培养，设置时间梯度，每个时间梯度设9个重复。在恒温摇床中震荡培养菌液。在每个时间点，取菌液离心获得上清液，使用Salkowski比色法测定吲哚含量。测量蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和沙福芽孢杆菌在530 nm处的OD值，并绘制其生长曲线；使用CAS固体培养基评估菌株产铁载体的能力；采用平板检测法和磷钼蓝比色法测定菌株的溶磷性能；使用含溴百里酚蓝的Aleksandrov培养基测定菌株的释钾能力；采用脱脂牛奶琼脂平板法检测菌株产蛋白酶的能力；使用含0.5 mol/L氯化钠的LB培养基评估菌株的耐盐性；通过在pH=9的LB培养基上培养来测试菌株的耐碱性。
4.2 扫描电子显微镜观察
使用扫描电子显微镜观察细菌形态。将盖玻片插入用于培养细菌菌株的固体培养基中。待细菌细胞附着于玻片后，取出盖玻片。随后用磷酸盐缓冲液冲洗沉淀，再加入2.5%戊二醛，室温固定2–4小时。固定后，将样品置于4°C冰箱中过夜。之后，用梯度乙醇冲洗样品，再用叔丁醇冲洗。冲洗后，加入20 μL叔丁醇，将混合物置于-20°C冰箱中直至冻结固化。经过临界点干燥和喷金处理后，使用扫描电子显微镜进行观察。
4.3 基因组测序与功能注释
基因组测序由北京百迈客生物科技有限公司完成。检测过程中，使用Thermo Fisher Scientific NANODROP2000和Invitrogen Qubit3 Fluorometer检测核酸浓度，并进行琼脂糖凝胶电泳以评估完整性。建库流程如下：使用G-TUBE片段化高质量核酸，然后使用NEBNext FFPE DNA Repair Mix和NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing Module完成损伤修复和末端加A。使用Nanopore EXP-NBD104试剂盒添加条形码序列，使用EXP-NBD114连接测序接头。对于测序，使用Nanopore EXP-FLP001.PRO.6芯片制备试剂盒制备Flow cell Priming mix，并使用SQK-LSK109连接测序试剂盒制备上机文库。在配备FLO-PRO002芯片的PromethION48测序仪上使用MinKnow软件进行测序。在基因组分析中，使用RepeatMasker v4.0.5识别重复序列，使用CRT v1.2检测CRISPR，应用IslandPath-DIMOB v0.2分析基因组岛，利用Prodigal v2.6.3注释编码基因，并使用KEGG数据库进行功能基因分类。
4.4 发酵液中吲哚类化合物的测定
发酵液中吲哚类化合物的检测由北京百迈客生物科技有限公司完成。菌株在液体培养基中培养3天后，通过离心分离培养基上清和菌体，随后进行冷冻干燥处理。使用ExionLC AD超高效液相色谱仪与QTRAP 6500+质谱仪系统联用。色谱分离条件如下：使用Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18色谱柱，流动相A为含0.1%甲酸的超纯水，流动相B为含0.1%甲酸的乙腈。基于预定的多反应监测模式分析色氨酸及其代谢物。通过优化去簇电压和碰撞能量确定每个MRM离子对的参数，并使用Analyst 1.
