《Environmental Microbiology Reports》：Transcriptome Analysis Reveals Cross-Kingdom Virulence Factors in Erwinia persicinaCp2
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本研究通过建立紫花苜蓿根部感染模型和小鼠灌胃模型，结合转录组测序（RNA-seq）技术，系统分析了桃色欧文氏菌（Erwinia persicina）菌株Cp2在侵染植物与动物宿主过程中的差异表达基因（DEGs）及其功能，鉴定出生物膜相关蛋白（Bap）是介导其跨界致病性的关键毒力基因，为理解病原菌跨宿主界别的感染策略提供了新见解。
引言
桃色欧文氏菌（Erwinia persicina）是一种革兰氏阴性、能产生水溶性粉红色色素的兼性厌氧细菌，属于肠杆菌科。它是一种机会性植物病原菌，可在紫花苜蓿（Medicago sativa）、菜豆（Phaseolus vulgaris）等多种植物上引起组织坏死和软腐病。尽管关于其引发动物疾病的报道较为罕见，但有研究显示它也能感染动物，如导致绵羊（Ovis aries）胀气、眼充血和淋巴炎症，以及引起小鼠肝坏死和肾脏组织弥散性血管内凝血，临床研究也发现其可引起人类尿道炎。这些证据表明，桃色欧文氏菌可能是一种能够跨界感染植物和动物的病原菌。一些已知的跨界病原菌，如绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa）和成团泛菌（Pantoea agglomerans），其部分致病机制在植物和动物界存在相似性，提示可能存在保守的毒力因子。本研究旨在利用转录组学和生物信息学方法，探究从紫花苜蓿种子中分离的桃色欧文菌Cp2菌株在感染紫花苜蓿和小鼠过程中的关键毒力基因，以阐明其跨界致病机制。
材料与方法
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实验设计与模型建立
本研究所用Cp2菌株（NCBI登录号：756944）分离自紫花苜蓿种子内部组织。研究建立了双模型系统：一个是模拟植物致病的紫花苜蓿根部感染模型，使用“骏能995”品种，接种浓度为109CFU/mL的Cp2菌悬液；另一个是评估哺乳动物感染的小鼠模型，使用18-22g的SPF级KM小鼠，通过灌胃方式给予相同浓度的Cp2菌悬液，每天两次，连续三天，对照组灌胃等体积无菌营养肉汤。动物实验获得了甘肃农业大学动物伦理委员会的批准。
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样本采集与病理学观察
在末次灌胃后24、48、72和96小时解剖小鼠，采集心脏、肝脏、肺、脾脏、胃和肾脏组织。一部分组织样本立即用液氮冷冻，用于后续转录组分析；其余组织用4%多聚甲醛固定，制备石蜡切片，通过TissueFAXS成像系统扫描和分析病理变化。
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RNA提取与转录组测序
根据病理切片观察，小鼠胃组织病变最为严重，因此选择灌胃后96小时的小鼠胃组织（Cp2-A）用于转录组分析。同时，还采集了Cp2细菌细胞（Cp2）、健康紫花苜蓿叶片（P）、健康小鼠胃组织（A）以及Cp2感染的紫花苜蓿叶片病健交界处组织（Cp2-P）。使用相应试剂盒提取总RNA，去除核糖体RNA（rRNA）后，构建cDNA文库，在Illumina NovaSeq 6000平台上进行PE150测序。每个样本设置三个生物学重复。
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生物信息学分析
使用fastp对原始测序数据进行质量控制和接头修剪，获得高质量clean reads。使用Subread软件将reads比对到桃色欧文氏菌Cp2、紫花苜蓿和小鼠的参考基因组。使用DESeq2软件包（版本4.2）进行差异表达基因（DEGs）分析，筛选标准为log2倍数变化（FC）≥ 1且校正后p值 < 0.05。对筛选出的细菌DEGs进行基因本体（GO）功能和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。此外，将所有细菌DEGs与毒力因子数据库（VFDB）和病原体-宿主相互作用数据库（PHI-base）进行比对，分析毒力因子和致病相关基因。本研究还选取了另一种跨界病原菌——紫花苜蓿泛菌（Pantoea alfalfasp. nov. CQ10）作为对照菌株进行比较分析。
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RT-qPCR验证
从转录组数据中筛选出8个表达差异显著的基因，以RNase P（rnpB）为内参基因，通过实时荧光定量PCR（RT-qPCR）验证RNA-seq结果的可靠性。
结果
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Cp2对小鼠病理变化的影响
灌胃Cp2后，小鼠在心脏、肺、肝脏、胃、脾脏和肾脏组织中均出现了不同程度的病变。心脏在72小时出现轻度脂肪变性，96小时观察到脂肪细胞浸润心肌纤维间隙。肺部出现广泛纤维组织增生和炎性细胞浸润。肝脏在24小时表现出弥漫性肝细胞水肿和胞质空泡化，48小时出现个别肝细胞坏死和核碎裂。胃组织在48小时出现胃上皮细胞明显剥脱，腺体结构紊乱。脾脏组织中红白髓界限模糊，中性粒细胞显著浸润。肾脏出现肾小球毛细血管扩张、刷状缘部分损伤，以及肾小球分叶、萎缩和系膜细胞减少。这些结果表明，Cp2能够通过灌胃进入小鼠体内，并在胃、肝、脾、肾等组织中引起显著的病理损伤。
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RNA测序数据与差异表达基因定义
对15个样本（含生物学重复）进行转录组测序，共获得约206.5 Gb的高质量数据。比对分析显示，在感染的紫花苜蓿叶片中，Cp2的基因表达量平均占比为3.93%，而在感染的小鼠胃组织中占比为0.07%。维恩图分析显示，Cp2在感染紫花苜蓿（Cp2-P vs Cp2）和小鼠（Cp2-A vs Cp2）后，共有34个细菌DEGs共同表达。具体而言，在Cp2-P vs Cp2组中鉴定出1402个细菌DEGs（548个上调，854个下调）；在Cp2-A vs Cp2组中鉴定出286个细菌DEGs（全部上调）；在Cp2-P vs Cp2-A组中鉴定出281个细菌DEGs（全部上调）。RT-qPCR结果验证了RNA-seq数据的可靠性。
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GO功能分类与KEGG通路富集分析
GO富集分析表明，在Cp2-P vs Cp2组中，上调的细菌DEGs显著富集在“有机氮化合物代谢过程”、“有机氮化合物生物合成过程”和“小分子代谢过程”等生物过程类别。下调的DEGs则主要富集在“转运”、“定位”和“转运蛋白活性”相关通路。在Cp2-A vs Cp2组中，下调的DEGs主要富集在“前体代谢物和能量的生成”类别。比较两个宿主（Cp2-P vs Cp2-A），上调的细菌DEGs主要富集在“细胞氮化合物生物合成”、“有机氮化合物代谢”、“有机氮化合物生物合成”和“氧化还原过程”等生物过程。
KEGG通路分析显示，在Cp2-P vs Cp2组，上调的细菌DEGs显著富集于“氨基酸生物合成”、“碳代谢”和“核糖体”等通路；下调的DEGs则富集于“ABC转运蛋白”、“多种环境中的微生物代谢”和“苯甲酸盐降解”等通路。在Cp2-A vs Cp2组，下调的DEGs主要与“次级代谢产物的生物合成”、“多种环境中的微生物代谢”和“碳代谢”相关。而在比较两个宿主的Cp2-P vs Cp2-A组中，上调的DEGs主要富集在“次级代谢产物的生物合成”、“多种环境中的微生物代谢”、“碳代谢”和“核糖体”通路。这些结果表明，Cp2在感染紫花苜蓿和小鼠后，其上调的DEGs大多集中在代谢和核糖体相关通路。
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DEGs的毒力因子分析
将细菌DEGs与VFDB数据库比对发现，Cp2在紫花苜蓿中注释到的毒力因子有454个（占32.38%），在小鼠中有108个（占27.76%），两者共有34个。在紫花苜蓿中，DEGs编码的毒力因子主要与“营养代谢因子”、“免疫”、“运动性”、“粘附”、“效应物递送系统”和“生物膜”相关。在小鼠中，则主要与“免疫”、“粘附”、“效应物递送系统”和“生物膜”相关。
与对照跨界病原菌CQ10比较发现，Cp2在紫花苜蓿和小鼠中共同表达的34个毒力基因里，CQ10也共同表达了2个，即生物膜相关蛋白Bap和免疫调节因子NAP。维恩图分析进一步揭示，在四个组（Cp2-P、Cp2-A、CQ10-P、CQ10-A）的细菌DEGs编码的毒力因子中，只有Bap是共同表达的。这表明Bap在Cp2感染紫花苜蓿和小鼠的过程中扮演了关键角色。
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DEGs在病原菌-宿主相互作用中的分析
将细菌DEGs与PHI-base数据库比对，在1969个DEGs中鉴定出82个与致病性相关的基因，可分为毒力降低、致病性未受影响和毒力增加（高毒力）等类别。与CQ10比较发现，两菌株在感染紫花苜蓿时有311个共同的致病基因，而在感染小鼠时只有1个共同的致病基因。维恩图分析显示，leuB是两个菌株在感染紫花苜蓿时共同表达的致病基因，而dps是在感染小鼠时共同表达的致病基因。
讨论
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植物病原菌可引起跨界动物疾病
本研究通过灌胃模型证实了Cp2对小鼠的致病性，与之前通过腹腔注射模型的研究结果（引起肝坏死等）既有相似也有不同。本研究发现胃黏膜细胞受损，推测Cp2可能通过粘附并定植在胃黏膜上皮细胞表面，引发进一步的炎症反应导致损伤。病理症状表明Cp2可进入小鼠肾脏并造成伤害，肝脏和脾脏组织也出现中度病变，这可能与Cp2或其生物膜成分（如胞外多糖EPS）引发的炎症反应有关。本研究中未发生小鼠死亡，可能与Cp2对动物的致病力相对较弱、小鼠免疫系统作用或灌胃与腹腔注射给药方式导致的药物循环路径不同有关。灌胃方式更接近牲畜的摄食行为。
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与植物-动物跨界病原菌相关的毒力基因
病原菌的致病性主要与其编码和产生的毒力因子有关。本研究利用双RNA-seq技术证实Cp2可跨界感染。筛选出的22个共有细菌DEGs主要富集在“核糖体”通路，提示核糖体可能在Cp2的毒力表达和调控中发挥作用。毒力因子分析发现，DEGs在感染两个宿主时主要富集在“免疫”、“运动性”和“生物膜”等通路，这与其它跨界病原菌依赖的毒力因子类型相似。与CQ10的比较凸显了Bap在介导跨界致病性中的核心作用。已有大量研究表明，Bap及其同源蛋白在多种细菌的生物膜形成、宿主定植和粘附中至关重要。PHI-base分析鉴定出的leuB和dps分别是与亮氨酸合成、细菌运动性/生物膜形成能力以及铁稳态调节相关的致病基因。综上所述，Bap是桃色欧文氏菌Cp2跨界感染中的关键毒力基因。
结论
本研究通过建立紫花苜蓿根部感染和小鼠灌胃模型，证实了桃色欧文氏菌Cp2对植物和动物的致病性。转录组分析全面揭示了Cp2的跨界毒力因子，其差异表达基因主要富集在与“生物膜形成”、“免疫逃避”和“运动性”相关的通路中。与另一跨界病原菌CQ10的比较分析，突显了生物膜相关蛋白（Bap）在介导跨界致病性中的关键作用。同时，鉴定出leuB和dps为在紫花苜蓿和小鼠感染过程中共同表达的毒力基因。这些发现为后续深入研究Cp2等跨界病原菌的关键毒力基因和通路奠定了坚实基础，并为相关疾病的防控提供了理论依据。
