《Environmental Microbiology Reports》：Investigation of Plant Growth Promotion Potential of Novel Compost-Derived Bacilli and Anticipating Their In Vivo Effectiveness Through Mathematical Modelling
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本研究通过一套创新的整合框架，系统地评估了市售堆肥中分离出的多株芽孢杆菌的植物促生（PGP）潜力。研究结合了详尽的体外功能特性定量（如营养活化、激素合成、抗逆酶活性、生物膜形成等）与在玉米和秋葵上的田间试验验证，并创新性地应用了一个基于多参数归一化的加权评分系统，对菌株进行综合排序。这项工作不仅筛选出具有显著应用前景的菌株，更重要的是提出了一种透明、可比较的评估方法，为从复杂环境中理性筛选高效植物根际促生菌（PGPB），推动可持续微生物农业的发展提供了科学依据。
引言
现代农业的集约化严重依赖合成化肥和农药，导致了土壤退化、土著微生物群落改变及环境健康问题。可持续农业实践日益重视通过有机改良剂和微生物生物投入来提升土壤肥力并减少化学品依赖。堆肥应用和植物根际促生菌的使用是两种优势互补的方法。堆肥作为一种经生物稳定的有机改良剂，可改善土壤结构、养分有效性和微生物活性。然而，市售非认证堆肥的质量，特别是其功能微生物组成，存在很大变异性和不确定性。在堆肥微生物组中，芽孢杆菌属因其形成芽孢的能力、代谢适应性以及在养分动员、植物激素合成、胁迫缓解和病原菌抑制方面的已知功能而备受关注。但现有研究多集中于单一或少数几个特性，缺乏对菌株多种功能特性的综合评估，也鲜有将体外功能数据与田间表现相关联的系统比较框架。因此，本研究旨在功能性地鉴定从市售本地堆肥中分离的可培养芽孢杆菌，并利用一个整合框架比较评估其植物促生能力。具体目标包括：分离鉴定菌株并评估其生物安全性相关表型；量化包括养分活化、植物激素产生、胁迫响应酶和生防相关活性在内的一系列植物促生特性；在玉米和秋葵上进行小规模田间试验评估菌株表现；应用一个加权的、基于归一化的多参数评分框架，根据菌株的总体功能谱进行综合排名。
材料与方法
2.1 堆肥取样与理化性质表征
堆肥样品采集自印度加尔各答的市售开放市场，代表了小农户常用的非认证有机改良剂。为减少批次差异，从三个独立商贩处收集样品并混合后进行理化分析，测定了pH、电导率、总有机碳、全氮、C:N比及多种宏量和微量养分含量。
2.2 堆肥样品中可培养细菌的分离与鉴定
通过系列稀释法在营养琼脂平板上分离可培养细菌，基于丰度获得了18个分离株。通过Kirby Bauer纸片扩散法，使用9种靶向不同类别和作用机制的抗生素对分离株进行药敏试验，依据临床实验室标准化协会（CLSI）建议评估其敏感性。对多种抗生素敏感、且对超过一类抗生素不敏感或耐药的菌株被选为合格菌株，用于进一步评估。
2.3 分子鉴定与系统发育分析
通过标准方法提取细菌分离株的基因组DNA，使用通用引物27F和1492R扩增16S rRNA基因进行分子鉴定。扩增产物经克隆和桑格测序，将所得序列通过BLASTn工具与NCBI核苷酸数据库进行分析，鉴定系统发育近缘种。通过多重序列比对，使用MEGA 7.0软件中的邻接法构建系统发育树，实现种水平的鉴定。序列提交至NCBI GenBank数据库并获得登录号。
2.4 生物膜形成与胞外聚合物提取
定性评估：使用添加了刚果红的脑心浸液琼脂培养基检测生物膜存在，出现黑色粘液状菌落为阳性。
定量评估：采用标准组织培养板法，在不同接种量下定量测定生物膜产量，通过测定570 nm处的光密度值，并与临界光密度值比较，将生物膜形成能力分为弱、中、强等级。
EPS提取与定量：培养细菌后离心收集上清，用冷乙醇沉淀胞外聚合物，对沉淀物进行生化分析，通过酚-硫酸法、Bradford法和DPA试剂分别定量测定EPS中的碳水化合物、蛋白质和胞外DNA含量。
2.5 植物促生特性的定性与定量评估
氮相关代谢活性：在添加溴百里酚蓝的改良Jensen培养基上定性检测固氮能力，通过培养基颜色从蓝绿色到黄色的变化指示硝化/氨化过程。
磷酸盐溶解：在Pikovskaya琼脂培养基上定性检测，并通过钒钼磷酸盐黄色标准分光光度法定量测定溶解的无机磷酸盐浓度。
钾溶解：在添加溴百里酚蓝的改良Aleksandrov琼脂培养基上定性检测，培养基颜色从绿变黄指示产酸和钾溶解。
2.6 植物激素产生
吲哚-3-乙酸：在添加或不添加前体L-色氨酸的条件下培养细菌，通过Salkowski试剂反应在540 nm处测定IAA浓度。
赤霉素GA3：采用改良的Hollbrook法，通过比色法在254 nm处测定培养5天和7天后GA3的浓度。
2.7 胁迫响应酶ACC脱氨酶的定性与定量评估
在添加3 mM ACC作为唯一氮源的最小Dworkin-Foster培养基上定性检测菌株生长。通过茚三酮-ACC比色法在570 nm处定量测定ACC脱氨酶活性。
2.8 与土壤健康和生物防治相关的酶活性
通过分光光度法测定了一系列酶的活性，包括：分解尿素的脲酶、降解纤维素的纤维素酶、降解木质素相关化合物的漆酶和木质素过氧化物酶、分解淀粉的淀粉酶、抗氧化胁迫的过氧化氢酶和过氧化物酶、降解病原菌细胞壁成分的蛋白酶、果胶酶和β-1,3-葡聚糖酶。均采用了文献中标准的分光光度或比色方法进行定量测定。
2.9 铁载体的定量评估与分类
采用铬天青S法定量测定铁载体产量，计算百分铁载体单位。通过四唑盐法和Arnow's法分别检测铁载体的类型（羟肟酸盐型或儿茶酚盐型）。
2.10 田间试验设计与植物生长评估
以玉米和秋葵作为单子叶和双子叶作物的代表进行田间试验。采用随机区组设计，每个处理设重复。将调整至约106CFU/mL的细菌培养物，在播种后15天、35天和55天（开花前期）分三次接种到植株根际区域。记录并比较接种组与未接种对照组的营养生长（株高、叶片数）和生殖生长（秋葵果实数、玉米籽粒灌浆率）参数。数据以平均值±标准差表示，采用单因素方差分析和Tukey HSD检验进行统计分析。
2.11 多参数归一化评分框架
为比较评估分离菌株的植物促生能力，建立了一个基于多参数归一化的评分系统，作为一个启发式和透明的优先排序工具，而非预测模型。
参数选择：选择了15个体外定量参数，涵盖生物膜形成、养分动员、植物激素、胁迫缓解、铁载体和多种酶活性，代表了不同的植物促生机制。
数据归一化：由于各参数尺度、单位和取值范围不同，采用最小-最大归一化技术将原始数据缩放到0-1的范围。
权重分配：根据文献中推断的相对农学重要性，对归一化值进行加权。赋予生物膜形成能力更高权重（因其对根际定殖和性状协调的重要性），养分溶解特性次之，植物激素产生、ACC脱氨酶活性和铁载体产生权重适中，土壤改良和生防相关酶活性权重较低但非零。所有权重之和为100。
分数计算与排名：计算每个菌株所有参数的加权归一化值之和，得到一个综合功能指数。更高的指数值表示基于所选特征的整体性能潜力更强，用于菌株排名。
敏感性与稳健性：通过敏感性分析测试评分框架的稳健性，在总权重不变的情况下，将单个因子权重正负变动10%，菌株的相对排名未发生改变。
结果
3.1 堆肥基本特性
所用堆肥pH为7.5，总有机碳303.1 g/kg，全氮20.5 g/kg，C:N比约为18:1，属于成熟稳定堆肥范围。含有相当量的P2O5（19.3 g/kg）、K2O（15.6 g/kg）及钙、镁、硫、铁、锰、锌、铜、硼等多种中微量元素。
3.2 细菌分离、药敏及选择
从堆肥中分离出18个不同的菌落，基于菌落特征差异和相对丰度，最终选择5株（命名为BT、BM、BS、PSB、KSB）进行深入研究。抗生素药敏谱分析显示，所选菌株对多种不同作用机制的抗生素表现出敏感性，支持了其在生物安全背景下的进一步功能表征。
3.3 分子鉴定与系统发育分析
通过16S rRNA基因测序和系统发育分析，鉴定菌株BT为Bacillus luti（登录号MZ229975），BM为Bacillus wiedmannii bv. thuringiensis（登录号MZ229894），BS、PSB和KSB均为Bacillus paramycoides（登录号分别为MW917244、MZ227489、MZ227495）。
3.4 生物膜形成与EPS提取
在BHI-刚果红琼脂上，菌株BT形成最旺盛的黑色粘液状菌落，BM和BS次之，PSB和KSB呈中等水平。定量分析（OD570）结合ODc值分类显示，BT和BM为强生物膜形成者，BS、PSB和KSB为中等形成者（尤其在20 μL接种量下）。EPS生化组成分析显示，碳水化合物是主要成分，其次是蛋白质，胞外DNA含量最低。BM的EPS碳水化合物含量最高。生物膜强度似乎更受EPS成分组织和平衡的影响，而非单一成分浓度。
3.5 植物促生特性的定性与定量评估
氮相关代谢活性：所有五株菌在改良Jensen培养基上均能生长，并引起培养基颜色从蓝绿到黄色的变化，表明具有固氮和硝化/氨化能力。BT、BM和BS在48-72小时内引起培养基快速变黄，PSB和KSB变化较慢。
磷酸盐溶解：所有菌株在Pikovskaya琼脂上均未产生明显透明圈。定量测定显示，所有菌株在72小时后溶解的磷酸盐浓度相近，属于低到中等的无机磷酸盐溶解者。
钾溶解：在改良Aleksandrov培养基上，BT和BM在菌落周围引起培养基完全变黄，表明钾溶解能力强。BS、PSB和KSB仅产生较小的变色晕圈，能力中等。
3.6 植物激素产生
IAA产生：在添加色氨酸的条件下，BT、BM和BS产生较高的IAA。PSB在不添加色氨酸时产量更高，KSB在两种条件下产量相当。这表明存在色氨酸依赖和独立的两条IAA合成途径。
GA3产生：培养7天时GA3产量均高于5天。BM产量最高，其次是PSB、KSB、BS，BT最低。
3.7 胁迫响应酶ACC脱氨酶
在添加ACC的DF培养基上，所有测试菌株均能生长，而对照菌株不能。定量测定显示，KSB的ACC脱氨酶活性最高，其次是BT、BS、PSB和BM。
3.8 与土壤健康和生物防治相关的酶活性
木质纤维素降解酶：菌株PSB在纤维素酶、木质素过氧化物酶和淀粉酶活性上表现最高。BS的漆酶活性最高。BT和BM在所有四种酶活性上表现中等。
生防相关酶：菌株BS在过氧化氢酶、β-1,3-葡聚糖酶和过氧化物酶活性上表现更好。PSB的蛋白酶活性最高，β-1,3-葡聚糖酶活性次之。BM的果胶酶活性最高，BT次之。
3.9 铁载体的定量评估与分类
基于百分铁载体单位，培养48小时后，BS、PSB和BT的值较高；而BM和KSB在24小时的值较高。所有五株测试菌株产生的铁载体均为羟肟酸盐型，未检测到儿茶酚盐型或混合型。
3.10 田间试验与植物生长评估
在玉米和秋葵的田间试验中，与未接种对照相比，接种处理（特别是BT和BM）显著提高了两种作物的株高和叶片数。在生殖生长方面，接种处理增加了秋葵的果实数量，并提高了玉米的籽粒灌浆率。这些结果与体外功能评分表现出一定的正相关性。
3.11 多参数评分与菌株排名
应用多参数归一化加权评分系统对五株菌进行综合排名。排名综合考虑了生物膜形成、养分溶解、植物激素产生、胁迫酶、铁载体及多种酶活性。评分结果显示，BT和BM获得了最高的综合得分，与它们在田间试验中表现出的显著促生效果一致。这个框架提供了一种系统化、可比较的方法来评估和优先选择具有多种植物促生特性的微生物菌株。敏感性分析表明，在权重发生合理变动时，菌株的排名顺序保持稳定，证明了该评分系统的稳健性。
