编辑推荐：
本综述深入探讨了犬尿氨酸（kynurenine）途径关键酶——吲哚胺2,3-双加氧酶2（IDO2）的结构与功能。文章通过详尽的谱学、生化和晶体学研究，揭示了IDO2催化效率远低于同工酶IDO1的结构基础，并阐明了其独特的底物结合模式与宽泛的配体识别谱。该研究不仅为理解IDO2在免疫、神经系统及肿瘤等疾病中的作用提供了新的分子框架，也为靶向IDO2的药物开发奠定了关键的结构生物学基础。
引言
L-色氨酸（L-Trp）是一种必需氨基酸，在体内主要通过犬尿氨酸途径代谢，该途径产生的代谢物在免疫调节和神经功能中扮演着重要角色。人体中存在三种L-Trp加氧酶调控犬尿氨酸途径的限速步骤：色氨酸2,3-双加氧酶（TDO）、吲哚胺2,3-双加氧酶1（IDO1）和吲哚胺2,3-双加氧酶2（IDO2）。其中，IDO2于2007年被发现，与IDO1有43%的序列同源性，但表现出显著不同的表达谱和功能特征。然而，IDO2表现出极低的L-Trp代谢活性，其体内功能尚不明确，且缺乏实验结构信息阻碍了对其结构-功能关系的深入研究。本研究旨在通过获取详细的酶学和结构信息来阐明IDO2的功能。
结果
IDO2的谱学和酶学性质
本研究使用了N端缺失13个残基的人源IDO2野生型（IDO2 WT）蛋白。与IDO1相比，IDO2的亚铁和亚铁-一氧化碳（亚铁-CO）形式的吸收光谱仅略有偏移，表明其血红素环境与IDO1大体相似。然而，IDO2对L-Trp的代谢活性极低，其周转数（kcat）约为IDO1的1/10，而米氏常数（Km）值高达2100 μM，约为IDO1的260倍。本征清除率（CLint= kcat/Km）极低，仅为IDO1的约1/2500。通过紫外-可见（UV–Vis）吸收光谱监测L-Trp结合后的变化，发现IDO2的光谱变化呈正弦波形，与IDO1结合D-Trp时的谱图相似，提示这是一种低效的结合状态。IDO2对L-Trp的解离常数（Kd）为122.2 μM，约为IDO1（37.9 μM）的3倍，表明尽管结合模式不同，IDO2仍以相对较高的亲和力结合L-Trp。
IDO2的晶体结构
为了解决IDO2结构信息缺失的问题，本研究进行了X射线晶体学分析。由于IDO2 WT蛋白不稳定，构建了更稳定的N端带有麦芽糖结合蛋白标签（MBP）的融合蛋白（MBP-IDO2），其生化性质与无标签IDO2相似。首先解析了MBP-IDO2的静息态结构，分辨率为2.45 ?。IDO2由一个小N端结构域和一个包含一个血红素分子的大C端结构域组成。血红素的铁原子与螺旋Q上的H360（对应于IDO1的H346）配位。整体结构与IDO1相似（CαRMSD = 0.85 ?）。
接着，通过将静息态晶体浸泡在含有L-Trp和氰化钾的溶液中，解析了MBP-IDO2与L-Trp和氰离子（CN?）复合物的结构，分辨率为2.25 ?。L-Trp通过氢键与R248、T395以及血红素的丙酸基团结合。L-Trp的Nε原子通过一个水分子与H143的Nδ原子间接作用。L-Trp的吲哚环与F180的苯基形成T型堆积。与静息态相比，L-Trp的结合诱导了催化位点周围的结构变化：JK-loop移动，其上的T395与L-Trp的氨基形成氢键，G396和T398与血红素的丙酸基团作用；R248的侧链重新定向，与L-Trp的羧基以及JK-loop上的R393的羰基氧相互作用，从而固定了JK-loop。
IDO1与IDO2的结构比较
比较IDO1和IDO2的L-Trp复合物结构发现，两者中L-Trp的吲哚环取向不同。在IDO1中观察到的构象称为Conf A，而在IDO2中观察到的称为Conf B。Conf A也存在于人源TDO的晶体结构中。这种差异主要归因于IDO2特有的两个氨基酸：H143和L146。H143可以通过水分子介导的相互作用稳定Conf B；而在IDO1中，该位置是Y126，阻止了水分子处于相似位置。L146在IDO2中占据了与Conf A构象的L-Trp产生空间位阻的位置；而IDO1中对应的C129可以通过范德华力稳定Conf A。此外，IDO1中的F164在IDO2中被体积较小的I181取代，为F180移动并与Conf B构象的L-Trp形成适当的T型堆积相互作用创造了空间。IDO2中CN?到L-Trp吲哚环的距离比IDO1中更长，例如CN?的N原子到L-Trp的Nε原子的距离在IDO2和IDO1中分别为4.2 ?和3.4 ?，这可以解释IDO2的低催化活性。
IDO2特异性残基His143突变的影响
为了进一步了解IDO2的底物识别，将His143突变为IDO1中对应的酪氨酸，构建了IDO2 H143Y突变体。该突变体的血红素环境与野生型几乎相同。其对L-Trp的Kd值为37.5 μM，与IDO1非常接近，且差示光谱形状也变得更像IDO1。酶活测定显示，H143Y突变体的催化效率（CLint）比IDO2 WT提高了1290倍，达到了IDO1的一半左右，这与早期突变研究一致。晶体结构分析（分辨率2.35 ?）证实，在H143Y突变体中，L-Trp以IDO1中观察到的Conf A构象结合，而非IDO2 WT中的Conf B。IDO2 H143Y中CN?到L-Trp吲哚Nε原子的距离（3.5 ?）与IDO1（3.4 ?）几乎相同，这解释了其显著更高的催化周转率。
在IDO1中，L-Trp的Nε原子通过两个水分子与Y126、E171和S267形成氢键网络。第一个水分子（W1）由S167稳定。然而在IDO2中，对应的残基是T184，其额外的甲基基团驱逐了形成上述氢键网络的水分子（W2）。尽管活性位点水分子的确切功能角色尚未完全阐明，但先前研究表明它们有助于塑造配体周围的静电环境，并且对于稳定O-O键断裂后形成的阴离子中间体（氧阴离子空穴）也很重要。因此，IDO2-H143Y中被破坏的氢键网络可能解释了其对L-Trp的活性仍低于IDO1。
IDO2对色氨酸类似物结合性质的评估
研究评估了IDO2 WT对八种色氨酸类似物的结合亲和力，包括1-甲基-L-色氨酸（L-1MT）、5-羟基-色氨酸（5HTP）、D-色氨酸（D-Trp）、色胺（TRY）、3-吲哚丙酸（3IPA）、血清素/5-羟色胺（5HT）、5-甲基-L-色氨酸（L-5MT）和5-甲氧基-L-色氨酸（L-5MoT）。L-1MT与IDO2 WT强结合（Kd= 15.6 μM）。5HTP结合很弱（Kd= 1920 μM）。D-Trp的Kd值（517 μM）高于L-Trp，但显著强于IDO1 WT与D-Trp的结合（Kd= 7180 μM），表明IDO2 WT对色氨酸的手性选择性相对较低。TRY和5HT的Kd值分别为1870 μM和260 μM。值得注意的是，5HT与IDO1孵育时未引起可测量的光谱变化，无法获得Kd值。H143Y IDO2对5HT的Kd为8880 μM，比IDO2 WT差约34倍，表明IDO2特有的H143参与了5HT的识别。3IPA与IDO1和IDO2的结合都很差。L-5MT和L-5MoT显示出相对较强的结合亲和力，Kd值分别为66.0 μM和35.2 μM。与同样在5位修饰的5HTP相比，这些化合物的解离常数更接近L-Trp，表明5位取代基的极性显著影响结合亲和力。这些结果表明，IDO2可能比IDO1容纳更多结构多样的配体，反映了其结合口袋更广泛的配体结合耐受性。
D-Trp、TRY、5HT和L-5MoT与IDO2的结合比与IDO1更强。其中5HT似乎很独特，因为本研究未观察到其与IDO1的结合。测定了这些化合物的酶活性。D-Trp或5HT未检测到活性，而L-5MoT和L-5MT的CLint值均高于L-Trp（分别为L-Trp的21.5倍和109.6倍）。这些值比相应的外消旋混合物高约一到两个数量级，表明IDO2能够以立体选择性的方式识别这些底物。
IDO2 H143Y突变体对5HT没有活性，但能代谢L-5MT和L-5MoT。其对L-5MT的CLint值约为WT蛋白的一半，表明用IDO1特异性的酪氨酸取代H143对该化合物的结合没有显著影响。相反，H143Y突变体对L-5MoT的催化活性比WT酶高约一个数量级。其Km值较小（25.6 μM）可能促成了这一数量级的差异。
IDO2与色氨酸衍生物复合物的晶体结构
为进一步阐明对色氨酸衍生物反应性和立体选择性的结构基础，进行了结构分析。解析了MBP-IDO2与5HT和CN?的复合物结构，分辨率为2.45 ?。与L-Trp相比，5HT结合时最显著的差异在于吲哚环的方向发生了翻转。因此，与配体吲哚环形成T型堆积的F180的位置在L-Trp和5HT复合物中不同。5HT的氨基和羟基分别与血红素的丙酸基团和H143形成氢键。与L-Trp不同，缺乏羧基的5HT不与R248相互作用。因此，R248没有发生结构变化，JK-loop保持在静息态观察到的位置。这表明配体羧基与R248的相互作用诱导了JK-loop的位移。在5HT结合中，吲哚环的位置接近Conf A，差示光谱在吸收最大值附近的ε较低，形状接近向下凹的曲线。然而，由于未检测到代谢活性且吲哚环略有位移，这种非生产性结合模式被指定为Conf A'。在Conf A'中，吲哚环上的Nε原子似乎没有与附近的水分子形成氢键，因为它面向血红素平面。
还解析了MBP-IDO2与5HTP的复合物晶体结构（分辨率2.68 ?）。5HTP的羧基与R248相互作用；然而，与L-Trp复合物数据相比，JK-loop的电子密度定义不清，表明JK-loop位置的重排未完全完成。5HTP的结合构象更类似于5HT而非Conf A的L-Trp，因为其羟基可能与H143形成氢键，尽管距离（3.6 ?）略长于典型氢键距离，且5HTP的结合位置相比5HT略有移动。这可能是因为5HTP的羧基和氨基分别保持与R248和JK-loop的相互作用，而其羟基不能同时与H143形成稳定的氢键，导致能量不利的构象。5HTP吲哚环周围的电子密度不清楚，表明其结合未得到良好稳定。事实上，5HTP的Kd值比5HT差7倍以上，且未观察到对5HTP的活性，这与之前的报告一致。
解析了MBP-IDO2与D-Trp和CN?的复合物结构，分辨率为2.50 ?。在该晶体结构中，D-Trp未出现在底物结合位点，而是出现在底物口袋入口附近。因此，JK-loop没有移动。结合位置的差异与D-Trp的低亲和力一致。如果D-Trp位于与L-Trp相同的位置，其Cα原子将与T385产生空间位阻，并且由于其取向，其氨基将无法与T385形成氢键。这种结构约束可能解释了为什么D-Trp不以与L-Trp相同的方式结合IDO2。D-Trp的羧基与R248形成氢键。D-Trp的氨基与L251和G279形成氢键。此外，D-Trp的Nε原子直接与CN?的N原子形成氢键。在这种情况下，D-Trp结合在不同于Conf A和B的位置，采用了Conf C结合模式。Conf C是一种非生产性结合模式，这与显示正弦波形的光谱数据一致。
解析了MBP-IDO2与CN?和L-5MT或L-5MoT的复合物晶体结构，分辨率均为2.50 ?。L-5MT和L-5MoT均以生产性构象Conf B结合，类似于L-Trp。在L-5MT复合物中，甲基与I181和V253有范德华接触。在L-5MoT复合物中，甲氧基的氧原子与H143的Nδ原子形成氢键，这可能有助于其相对较高的结合亲和力。这些结构观察结果与酶活性数据一致，即L-5MT和L-5MoT是比L-Trp更好的底物。研究还解析了IDO2 H143Y突变体与L-5MT和L-5MoT的复合物结构。在H143Y-L-5MT复合物中，L-5MT以Conf A构象结合，类似于该突变体中的L-Trp。吲哚Nε原子通过一个水分子与Y143相互作用。在H143Y-L-5MoT复合物中，L-5MoT也采用Conf A构象。甲氧基的氧原子与Y143的羟基形成氢键，距离为2.8 ?。该氢键可能有助于H143Y对L-5MoT的高催化活性。
讨论
本研究通过综合的晶体学、光谱学和生化分析，深入揭示了人源IDO2的独特性质。研究发现IDO2以一种翻转的构象（Conf B）结合其经典底物L-Trp，这是由其特异性残基H143（通过水分子介导的相互作用）和L146（空间位阻）所稳定的。这种结合模式导致底物吲哚环与激活的氧/氰化物配体之间的距离增加，从而严重损害了催化效率。将H143突变为IDO1中对应的酪氨酸（Y）可以恢复IDO1样的结合模式（Conf A），并使催化活性提高超过1000倍，这强有力地证明了该残点在决定酶功能中的核心作用。
研究进一步展示了IDO2结合口袋的显著可塑性，它能够容纳多种色氨酸衍生物。其中，L-5MT和L-5MoT能以生产性构象结合并被有效代谢，其催化效率甚至高于L-Trp。相比之下，5HT和D-Trp则采用非生产性构象结合（分别为Conf A'和Conf C），解释了它们缺乏催化活性的原因。这种宽泛的配体识别谱，加上对D-Trp相对较低的手性选择性，提示IDO2可能在其生理环境中作用于L-Trp以外的、尚未被识别的内源性底物，或者其功能可能超越经典的酶催化活性，涉及蛋白质-蛋白质相互作用等非酶功能。
这些结构生物学发现为理解IDO2在多种疾病背景下的复杂作用提供了分子框架。例如，IDO2在癌症、自身免疫和神经系统疾病中的表达失调已有报道，但其确切角色常显得矛盾。本研究阐明的低活性结构基础及其独特的底物结合特性，有助于调和这些看似矛盾的数据。它提示IDO2的生理功能可能不主要依赖于高效的L-Trp代谢，而是通过其结合特性来调节局部色氨酸可用性、隔离配体，或通过非催化机制传递信号。此外，对IDO2与各种抑制剂及色氨酸衍生物相互作用的详细结构解析，为合理设计高选择性的IDO2抑制剂或IDO1/IDO2双重抑制剂奠定了坚实基础，这对于开发针对癌症免疫逃逸等相关疾病的新疗法具有重要意义。
