《European Journal of Immunology》：Single-Cell Profiling of Splenic Immune Ageing and Chronic Stress Adaptations in Mice With Natural Microbiota
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本研究通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）描绘了拥有天然菌群（NM）的小鼠在年轻、年老及慢性应激（CVS）状态下脾细胞的免疫图谱。研究发现，衰老导致淋巴细胞功能受损和应激反应增强，具体表现为Gzmk+CD8+T细胞的异质性增加与功能改变、NK细胞和巨噬细胞功能失调。慢性应激则引发了适度的、部分逆转衰老相关变化的免疫重塑。研究进一步整合了多个已发表数据集，构建了一个包含超过27.2万个脾细胞的综合图谱，鉴定出跨数据集保守的衰老特征，为系统性理解脾脏免疫衰老提供了关键资源和见解。
研究概览
随着衰老，免疫系统的组成、转录组和功能在各组织中发生显著改变。脾脏作为最大的次级淋巴器官，在衰老过程中的作用日益重要，但其在天然菌群和慢性应激背景下的免疫衰老景观仍未得到充分探索。为了弥补这一空白，本研究对拥有天然菌群（NM）的年轻（4月龄）、年老（22-24月龄）以及接受慢性可变应激（CVS）处理的年老小鼠脾脏进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析，以解析微生物环境和慢性应激对免疫衰老的影响。研究进一步整合了五个已发表的无特定病原体（SPF）小鼠数据集，构建了一个包含超过27.2万个脾细胞的综合性衰老小鼠脾脏图谱，旨在识别跨数据集保守的衰老特征，并评估菌群和慢性应激的作用。
2.1 研究设计与单细胞图谱构建
研究纳入了年轻、年老及经历14天CVS处理的年老NM小鼠。经质量控制（QC）和数据整合后，共获得78,185个脾细胞，并根据经典标记基因注释为B细胞、T细胞、NK细胞、巨噬细胞、经典/非经典单核细胞、树突状细胞、浆细胞等多种免疫细胞亚群。分析显示，衰老主要改变了淋巴细胞的比例，并显著减少了部分髓系细胞（如巨噬细胞、浆细胞样树突状细胞和嗜碱性粒细胞）。
2.2 年龄相关的脾脏免疫景观重塑
差异表达基因（DEG）分析揭示了衰老带来的具体转录变化。衰老的NK细胞下调了与迁移、成熟和细胞毒性相关的基因，而上调了生存相关基因。衰老的巨噬细胞表现出促炎但功能受损的表型，表现为炎症介质的表达上调和干扰素反应等功能相关基因的下调。经典和非经典单核细胞共同表现出I型干扰素相关基因的下调和炎症调节基因的上调。有趣的是，慢性应激对脾细胞比例和转录组谱的影响甚微，但它部分逆转了衰老趋势，例如增加了T细胞、增殖性B细胞和髓系细胞，同时减少了B细胞和增殖性T细胞，提示了补偿性的免疫重塑。
2.3 T细胞异质性和转录程序的年龄诱导性改变
通过对T细胞进行高分辨率亚群聚类，研究鉴定了包括初始（CD4N, CD8N）、效应记忆（EM）、调节性T细胞（Tregs）等多个亚群。衰老导致了一个明显的从初始表型向效应记忆表型的转变，并伴随效应Tregs和T滤泡辅助细胞（Tfh）的扩增。DEG分析发现，无论是初始还是效应记忆T细胞，衰老都下调了与静息和迁移相关的基因，而上调了与分化、应激反应相关的基因。这表明衰老将T细胞从静息状态重新导向应激适应性的激活状态。
2.4 Gzmk+CD8+T细胞的转录异质性
Gzmk+CD8+T细胞是先前报道的与年龄相关的T细胞亚群。本研究进一步将其细分为Gzmk高表达（Gzmk-hi）和Gzmk低表达（Gzmk-lo）两个亚群。衰老使比例向Gzmk-lo亚群偏移，而慢性应激部分缓解了这种变化。重要的是，衰老对这两个亚群施加了不同的脆弱性：Gzmk-hi细胞表现出耗竭特征，而Gzmk-lo细胞则表现出炎症特征。
2.5 年龄相关的脾脏B细胞变化
B细胞亚群分析鉴定出了过渡型B细胞、滤泡B细胞、生发中心B细胞、记忆B细胞、年龄相关B细胞（ABCs）等多个亚型。衰老导致成熟（记忆B细胞、Apoe高表达B细胞、ABCs）和调节性（调节性B细胞）表型扩增，同时耗竭了初始（过渡型、滤泡、边缘区B细胞）和生发中心B细胞亚群。慢性应激加剧了过渡型B细胞的耗竭并增加了调节性B细胞，提示在糖皮质激素暴露下调节性偏向增强。转录分析表明，衰老的B细胞表现出分化、激活失调，但迁移和生存能力增强。
2.6 构建衰老脾脏的综合单细胞转录组图谱
为了获得脾脏免疫衰老的全面视图，研究将NM小鼠数据集与五个已发表的SPF小鼠scRNA-seq数据集进行了整合，构建了一个包含272,850个脾细胞的图谱。图谱级别的注释识别了所有主要的脾脏免疫谱系，证实了B细胞最丰富，其次是T细胞，并解析了在NM数据集中未区分的细胞类型，如暴露的巨噬细胞和组织驻留单核细胞。
2.7 跨数据集分析鉴定保守的淋巴细胞衰老特征
跨数据集的比较分析揭示了保守的衰老相关变化。在细胞组成上，衰老一致性地减少了NK细胞和浆细胞样树突状细胞，同时增加了未成熟中性粒细胞和浆细胞。T细胞图谱证实了初始-记忆细胞的失衡以及效应Tregs和Tfh细胞的扩增。B细胞图谱则显示了过渡型B细胞和滤泡B细胞的稳健减少，以及Apoe高表达B细胞和记忆B细胞扩增的趋势。值得注意的是，与SPF数据集相比，年老NM小鼠的记忆B细胞显著增加，表明持续的微生物群暴露在其生成中扮演了角色。
在转录水平上，跨数据集DEG分析在淋巴细胞而非髓系/基质细胞中揭示了保守的衰老特征。保守的NK细胞衰老特征包括细胞毒性基因的丢失。T细胞亚群表现出保守的应激和生存驱动转录程序：初始T细胞丢失Il7r和Lef1，同时获得Socs3和Rbm3；效应记忆T细胞则获得促生存、耗竭和炎症介质相关基因，同时丢失与自我更新相关的因子。B细胞也表现出上调应激反应和浆细胞分化基因，同时下调B细胞信号调节因子的平行模式。这些发现突显了跨T、B细胞的应激适应、生存和效应偏向的保守衰老特征。
3 讨论与展望
本研究构建的衰老小鼠脾细胞单细胞转录组图谱，为理解脾脏特异性免疫异质性提供了高分辨率见解。衰老在淋巴细胞谱系中施加了趋同的转录程序，从根本上将免疫优先级从病原体防御重新定向为通过增强应激适应和调节性偏向来实现细胞自我保存。Gzmk+CD8+T细胞的两个亚群在衰老过程中分别走向耗竭和炎症，可能是驱动炎症衰老和组织病理学的因素。B细胞区室向成熟和年龄相关亚群偏移，伴随分化和激活基因的减少，这可能削弱疫苗反应并促进自身免疫。尽管慢性应激在老年小鼠中引起的改变相对温和，但它提示年龄相关的转录重编程主导了细胞景观。
通过整合多个SPF数据集，研究从由品系、平台和微生物群塑造的环境依赖性变异中，识别出了跨研究的衰老特征（如NK细胞毒性侵蚀、初始向效应表型转变、记忆偏向的B细胞状态）。这些保守的特征包括NK细胞成熟和细胞毒性降低，初始T细胞静息维持受损，效应T细胞获得炎症/耗竭/生存基因，以及B细胞应激/分化基因上调而信号调节因子减少。总的来说，脾脏免疫衰老表现为T和B细胞谱系从激活和可塑性向生存、应激适应和效应状态协调转变。
本研究也存在一些局限性，如品系和测序平台的变异性、慢性应激范式的单一时间点、以及缺乏特定细胞亚群（如ABCs）的功能验证。未来的研究方向包括纳入多组学模态、纵向采样和更广泛的组织覆盖，以捕捉NM小鼠的系统性衰老轨迹。解析品系、性别和微生物群的贡献，对于将小鼠的发现转化到人类免疫衰老至关重要。
4 方法总结
研究使用了年轻和年老雌性Balb/c NM小鼠，其中部分年老小鼠接受了为期14天的慢性可变应激处理。通过酶免疫法测定血清皮质酮水平。脾细胞分离后使用Parse Biosciences的WT试剂盒进行单细胞RNA测序。原始数据使用Split-pipe流程处理，并在Scanpy中进行质量控制、整合（使用scVI模型校正批次效应）和聚类分析。差异表达基因分析在NM数据集上使用DESeq2进行，在图谱水平上使用Wilcoxon秩和检验进行。细胞类型比例的比较使用Welch t检验，跨数据集的年龄相关变化则通过随机效应荟萃分析进行量化。
