《Journal of Extracellular Vesicles》：Engineered CAR-T–Derived Exosomes Co-Delivering miR-145 and Cytotoxic Proteins for Targeted Solid Tumour Therapy
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本研究发现，利用靶向B7-H3的工程化嵌合抗原受体T细胞来源的外泌体（CAR-T-exo），并加载微小RNA miR-145，成功构建了一种新型、无细胞的协同纳米治疗平台。该平台（exo-CT-145）能够靶向蓄积于食管鳞状细胞癌，通过激活caspase-3凋亡通路、逆转上皮-间质转化（EMT）和抑制血管生成，在体内外均表现出显著抗肿瘤活性，且避免了细胞因子释放综合征等系统性毒性，为克服实体瘤治疗的困境提供了兼具高效与安全性的新策略。
1 引言
嵌合抗原受体T细胞疗法是肿瘤免疫治疗领域的革命性突破，但在血液瘤中取得的显著成功难以复制到实体瘤治疗中。实体瘤存在肿瘤浸润受限、免疫抑制性肿瘤微环境等挑战，并且活化的CAR-T细胞系统性扩增可能引发严重的细胞因子释放综合征，限制了其临床应用。为了克服这些限制，外泌体作为一种天然的细胞间通讯载体，凭借其纳米级尺寸、良好的生物屏障穿透能力和靶向富集特性，展现出作为治疗替代方案的巨大潜力。源自免疫细胞（如CAR-T细胞）的外泌体天然携带CAR分子和颗粒酶、穿孔素等细胞毒性物质，具备一定的肿瘤杀伤能力，且不表达程序性细胞死亡蛋白1，可避免肿瘤细胞介导的免疫抑制，是极具前景的直接攻击者。
食管鳞状细胞癌是一种恶性程度高、预后差的致命性恶性肿瘤。免疫检查点分子B7-H3在ESCC等多种实体瘤中异常高表达，与肿瘤进展、免疫抑制和血管生成密切相关，是理想的治疗靶点。与此同时，微小RNA miR-145在多种肿瘤组织中表达下调，被公认在癌症进展中起抑制作用，它可通过靶向AKT3、PLCE1等不同受体蛋白，调控PI3K/AKT等多条信号通路，从而抑制肿瘤的发生发展。
本研究旨在将上述生物学见解转化为有效的治疗策略，通过工程化改造靶向B7-H3的CAR-T细胞来源外泌体，并同时加载具有肿瘤抑制功能的miR-145，构建一种双功能治疗平台（exo-CT-145）。该策略独特地整合了细胞毒性受体介导的靶向杀伤与miR-145驱动的肿瘤促进行径路抑制，旨在通过诱导细胞凋亡、逆转EMT和抑制血管生成来增强治疗结局。
2 材料与方法
研究使用了来自中国科学院细胞库的多种细胞系。通过将靶向B7-H3的CAR慢病毒载体与包装质粒共转染HEK-293T细胞来包装慢病毒，并用其转导从健康成人供体分离、经抗CD3/CD28抗体激活的外周血单个核细胞，从而制备CAR-T细胞。通过抗原特异性刺激CAR-T细胞并收集培养上清，经过序贯离心纯化获得CAR-T来源外泌体，并使用外泌体核酸加载试剂盒将miR-145模拟物加载到外泌体中，形成exo-CT-145。通过透射电镜、纳米颗粒跟踪分析、Western blot、ELISA等方法对外泌体进行表征。通过MTT、伤口愈合、Transwell、流式细胞术检测细胞活力、迁移、侵袭和凋亡。利用KYSE150细胞球体评估外泌体渗透能力。通过人脐静脉内皮细胞管形成实验评估抗血管生成效果。最后，在雌性裸鼠皮下接种KYSE-150细胞构建ESCC异位移植瘤模型，评估exo-CT-145的体内靶向性、抗肿瘤效果及安全性。
3 结果
3.1 B7-H3在ESCC中的表达
通过分析TCGA、GTEx及ESCCdb数据库，结合免疫组化及Western blot验证，证实B7-H3在食管癌组织及多种ESCC细胞系中相较于癌旁组织或正常人食管上皮细胞均显著高表达。
3.2 CAR-T细胞的构建与表征
成功构建了靶向B7-H3的CAR-T细胞，流式检测其转导效率达93.5%。乳酸脱氢酶释放实验证实，所构建的CAR-T细胞能以效应细胞与靶细胞比例依赖的方式，有效杀伤高表达B7-H3的KYSE30和KYSE150细胞，而未转导的T细胞杀伤效果显著减弱。
3.3 外泌体的表征
透射电镜显示exo-CT-145具有典型的茶托状形态，平均尺寸约为115 nm，平均ζ电位为-20.6 mV。RT-PCR证实其miR-145含量较exo-CT提升超过30倍。Western blot证实其表达CAR、CD9、TSG101、ALIX等外泌体标志蛋白，而不表达内质网标志蛋白钙联接蛋白。ELISA定量显示，exo-CT和exo-CT-145中的颗粒酶B和穿孔素含量显著高于源自普通T细胞的外泌体。细胞摄取实验表明，携带CAR的exo-CT和exo-CT-145能被高表达B7-H3的KYSE30和KYSE150细胞更有效地内化，而对正常HEEC细胞的摄取较弱。
3.4 体外治疗效果
在过表达B7-H3的KYSE30和KYSE150细胞中，exo-T、exo-CT和exo-CT-145均表现出剂量依赖的细胞毒性。在1 mg/mL浓度下，exo-CT和exo-CT-145能更显著地降低癌细胞存活率，而对低表达B7-H3的HEEC细胞毒性最小。Transwell侵袭和伤口愈合迁移实验进一步验证，exo-CT-145对KYSE150和KYSE30细胞的侵袭和迁移能力抑制效果最强。
3.5 外泌体在ESCC球体中的浸润及诱导凋亡
通过构建KYSE150细胞球体并利用荧光标记，共聚焦显微镜观察证实exo-CT和exo-CT-145能有效渗透至球体内部至少50 μm深度。流式细胞术凋亡检测显示，exo-CT-145处理能最有效地诱导KYSE150和KYSE30细胞发生凋亡，对HEEC细胞的促凋亡作用相对较弱。
3.6 外泌体抑制血管生成、激活caspase-3凋亡通路并逆转EMT过程
人脐静脉内皮细胞管形成实验表明，exo-CT-145表现出最强的抗血管生成效果。机制研究表明，exo-CT和exo-CT-145能通过激活caspase-3和caspase-9通路诱导细胞凋亡，伴随促凋亡蛋白Bax的上调和抗凋亡蛋白Bcl-2的下调。同时，exo-CT-145中携带的miR-145能靶向抑制N-钙黏蛋白的表达，从而导致上皮标志物E-钙黏蛋白水平上升、间质标志物N-钙黏蛋白水平下降，实现对上皮-间质转化过程的逆转。
3.7 体内治疗效果
活体成像显示，经尾静脉注射后，DiR标记的exo-CT和exo-CT-145能更长时间地在荷瘤小鼠体内循环，并在肿瘤部位特异性富集，其肿瘤部位的荧光信号强度约为exo-T的6倍。在ESCC裸鼠移植瘤模型中，连续21天给药后，exo-CT和exo-CT-145能显著抑制肿瘤生长，其中exo-CT-145效果最优，最终肿瘤体积和重量最小。治疗期间小鼠体重保持稳定，未观察到明显的肝肾功能损伤或组织病理学异常。对血清中IL-2、IL-8、TNF-α等细胞因子水平的动态监测也未发现细胞因子风暴的迹象。生存分析显示，exo-CT-145治疗组小鼠的中位生存期最长。
3.8 外泌体抑制ESCC的机制
对治疗后肿瘤组织的分析显示，exo-CT-145处理能显著降低肿瘤组织中与血管生成密切相关的CD31、VEGF和MMP9蛋白的表达水平。同时，Western blot结果证实，exo-CT-145在体内同样能上调cleaved caspase-3和Bax，下调Bcl-2，激活凋亡通路；并上调E-钙黏蛋白，下调N-钙黏蛋白，逆转EMT过程。这些体内结果与体外观察到的机制完全一致。
4 讨论
与传统CAR-T细胞疗法相比，外泌体这种无细胞效应器可能减轻某些产品驱动的毒性，且对某些检查点介导的抑制通路不敏感。其纳米尺寸使其能有效穿透实体瘤致密的细胞外基质。本研究中，CAR-T来源外泌体高水平的颗粒酶和穿孔素是其诱导凋亡的关键。颗粒酶B可通过激活caspase级联反应诱导线粒体途径的细胞凋亡。研究证实exo-CT-145处理能上调cleaved caspase-3和caspase-9，调节Bax/Bcl-2比例，表明其通过caspase-3通路诱导凋亡。
外泌体是递送治疗性药物、miRNA或siRNA的理想平台。本研究中，exo-CT-145携带的miR-145被证实可直接靶向N-钙黏蛋白基因的3‘UTR，导致其蛋白水平降低，从而逆转EMT。此外，exo-CT-145在体内能有效抑制肿瘤血管生成，表现为CD31、VEGF和MMP9表达的下降。将小核酸药物的优势与CAR-T外泌体的天然靶向性和细胞毒性相结合，是一种充满前景的治疗策略。源自多靶点CAR-T细胞的外泌体可能在表面呈现多个靶点，这种经过改造的CAR-T细胞来源外泌体不仅有望提高治疗效力，还能改善安全性。
需要指出的是，本研究的局限性在于使用了免疫缺陷的裸鼠模型，无法评估外泌体与完整免疫系统的相互作用。此外，由于CAR是针对人B7-H3设计的，且未测试其与小鼠同源物的结合，因此该模型无法准确预测B7-H3在人体正常组织中表达可能带来的脱靶毒性风险。本研究中提到的“安全性改善”严格限于外泌体平台相较于活细胞在减轻产品驱动的系统性炎症反应方面的优势。
5 结论
该研究证明，富含细胞毒性分子和表面CAR的CAR-T细胞来源外泌体，在体内外均能有效靶向并杀伤实体瘤。负载miR-145的外泌体在ESCC模型中能抑制肿瘤生长、血管生成和EMT进程，同时展现出良好的安全性，避免了免疫抑制性肿瘤微环境和细胞因子释放综合征。这项研究凸显了CAR-T外泌体作为一种有前景、安全有效的癌症纳米治疗策略的潜力，为传统CAR-T细胞疗法提供了一种潜在的替代方案。
