《Journal of Extracellular Vesicles》：Extracellular Vesicles From Mesenchymal Stromal Cells Drive Muscle and Neuronal Regeneration Through TNFα Modulation
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本文探讨了源自人脐带间充质基质细胞的GMP级细胞外囊泡（EVs），在模拟肌肉-神经微环境的体外三维（3D）模型中，如何通过调控肿瘤坏死因子-α（TNFα）信号通路，发挥抗炎与促再生作用，为EVs在治疗肌肉损伤与神经病变领域的临床应用提供了新的见解与机制证据。
1. 引言
肌肉缺损可由创伤、肿瘤切除和先天畸形导致，影响着儿科和成人患者。间充质基质/干细胞（MSC）来源的细胞外囊泡（EVs）已被证实具有促进神经-肌肉再生的潜力，但其具体作用机制尚不明确。本研究旨在利用三维（3D）体外模型，探究EVs在体外的神经-肌肉再生机制。
骨骼肌损伤与再生过程中，一个关键通路是肿瘤坏死因子-α（TNFα）信号。TNFα是一种细胞因子，在炎症和肌肉损伤中会增加免疫细胞募集，诱导肌肉蛋白分解代谢、肌纤维凋亡和收缩功能受损。同时，小非编码RNA，如微RNA（miRNA）在炎症过程中扮演关键角色，可抑制TNFα等促炎基因表达。为了克服理解EVs在肌肉恢复中作用机制的挑战，并揭示其对组织再生的影响，本研究利用三维体外模型，在分子水平上研究了EVs促进肌肉和神经修复的具体机制。
2. 材料与方法
研究构建了两种三维体外模型。一是人肌肉脱细胞组织（ECM）与人肌肉前体细胞（hMPCs）和巨噬细胞THP-1（M0）共同工程化形成的功能肌肉模型。二是取自大鼠胎儿的器官型脊髓组织模型。此外，还利用经脂多糖（LPS）刺激的原代小胶质细胞研究了神经炎症。在肌肉模型中，通过肌毒素（CTX）诱导损伤，并使用GMP级EVs、TNFα抑制剂SPD304及miR-145-5p抑制剂等进行处理。通过功能分析、蛋白质和基因表达谱，评估了EVs的作用效果。
关键的实验方法包括：
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hMPCs与巨噬细胞共培养：建立了2D和3D共培养体系，以模拟肌肉损伤后的细胞微环境。
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人肌肉ECM脱细胞与再细胞化：比较了脱氧胆酸钠（SDC）和拉春库林B（Latrunculin B）两种脱细胞方法的效果，最终选用拉春库林B（500 nM，两个循环）处理人肌肉活检组织，因其能更有效地去除DNA，同时更好地保留层粘连蛋白、胶原蛋白等关键ECM蛋白结构和机械性能。随后，将hMPCs和巨噬细胞共同微注射到脱细胞ECM中，进行再细胞化。
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EVs生产与表征：从人脐带组织中提取MSC，并在GMP合规条件下生产EVs，通过纳米颗粒追踪分析、cryo-TEM和表面标志物检测对其进行表征。
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功能与分子分析：包括张力抵抗实验、肌生成指数评估、免疫荧光染色、实时定量PCR、细胞因子蛋白芯片分析及小RNA测序等。
3. 结果
3.1 EVs保护hMPCs并在标准培养条件下改善其肌生成潜能
在构建3D肌肉模型前，研究首先在2D共培养平台上测试了EVs的效果。结果显示，无论在有无巨噬细胞共培养的情况下，CTX损伤均显著降低了hMPCs的肌生成融合指数。然而，EVs处理后，肌生成指数显著回升，甚至达到与未损伤样本相当的水平，表明EVs能保护肌管免受急性损伤，并改善其肌生成潜能。此外，巨噬细胞的加入本身就能显著提高hMPCs的肌生成指数，印证了巨噬细胞在促进肌肉细胞分化和成熟中的作用。
3.2 人脱细胞肌肉可构建功能化的三维肌肉模型
研究优化了人肌肉组织的脱细胞方法。相较于SDC，拉春库林B能在更短循环内有效去除DNA，并更好地保留了层粘连蛋白、胶原等ECM结构和机械性能。利用该脱细胞ECM，与hMPCs和巨噬细胞M0共同构建的三维工程化肌肉模型，显示出均匀的细胞分布、新生肌管（表达胚胎型肌球蛋白重链eMHC）的形成，并具备一定的电刺激收缩功能，表明成功构建了一个功能性的三维人类骨骼肌模型。
3.3 EVs保护肌肉模型免受损伤，其效果可被TNFα抑制所模拟
在三维肌肉模型中，CTX损伤导致肌源性成分减少，促炎基因MCP1表达上调，而抗炎基因ARG1表达下调。损伤还导致凋亡细胞标志物cCAS3+有增加趋势，增殖细胞标志物Ki67+有减少趋势。EVs处理可显著逆转这些变化，减少细胞凋亡，增加细胞增殖，并促进巨噬细胞向抗炎M2表型（ARG1+）极化。值得注意的是，使用TNFα抑制剂处理损伤样本，可产生与EVs处理相似的保护效果，提示EVs的作用机制可能与抑制TNFα相关。
3.4 EVs通过调节miRNA表达调控凋亡、炎症并刺激肌肉再生
研究发现，GMP级EVs富含多种与炎症和组织再生相关的miRNA，如miR-145-5p、miR-21-5p等。在三维肌肉模型中，CTX损伤导致miR-145-5p和miR-21-5p表达显著上调，而EVs或TNFα抑制剂处理可使其下调。同时，EVs处理上调了促肌源性分化因子MYOD的表达。在分子水平上，CTX损伤显著上调了TNFα的基因和蛋白表达，而EVs处理则能有效抑制其表达。此外，EVs处理还显著上调了抗炎细胞因子IL-10和趋化因子RANTES的表达。抑制miR-145-5p会加剧TNFα的表达，进一步证实了miR-145-5p在EVs介导的炎症调节中的作用。
3.5 EVs通过降低TNFα强烈抑制小胶质细胞神经炎症
在LPS诱导的原代小胶质细胞炎症模型中，高剂量（3 × 109）的EVs处理可显著抑制LPS引起的TNFα释放，并提高细胞活力，验证了EVs在神经炎症环境中的抗炎能力。
3.6 EVs通过激活TNFα通路促进胚胎大鼠脊髓器官型3D模型的神经轴突发芽
在大鼠胚胎脊髓器官型（oSpC）3D培养模型中，EVs可被神经元有效摄取。经EVs处理的oSpC，在培养48小时后，神经轴突的投射长度和数量均显著增加。同时，EVs处理下调了oSpC中miR-145-5p以及TNFα的基因和蛋白表达，并上调了与神经炎症调节和细胞生长相关的蛋白TIMP-1和ICAM-1的表达。抑制miR-145-5p则会缩短轴突投射，并上调TNFα表达，再次证实了EVs通过miR-145-5p/TNFα轴发挥促神经再生作用。
4. 讨论
本研究利用仿生三维模型，揭示了GMP级MSC-EVs通过调节TNFα信号通路促进肌肉和神经再生的新机制。成功构建的基于人脱细胞ECM、hMPCs和巨噬细胞的三维肌肉模型，能有效模拟损伤与修复过程。EVs通过其携带的miRNA（如miR-145-5p）等活性物质，下调TNFα表达，抑制细胞凋亡和过度炎症，促进巨噬细胞向修复表型转化，并激活肌肉再生相关基因（如MYOD）表达。此外，EVs在脊髓模型中也展现出通过相似机制促进轴突生长、调节神经炎症的能力。这些发现为EVs治疗肌肉退行性疾病、神经损伤及相关疾病提供了坚实的机制基础和理论支持，并凸显了三维模型在机制研究中的重要性。未来需进一步研究生理变量对EVs活性的影响，以推动其临床转化。
