《Journal of Extracellular Vesicles》：Neuronal Extracellular Vesicles Carrying APOE Downregulate Filament Actin Polymerization Signaling to Inhibit Synapse Formation in Alzheimer's Disease
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本研究揭示了阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）中神经元源性胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）在突触损伤传播中的新机制。研究发现，源自AD模型（APP/PS1）小鼠神经元的EVs（APPNEVs）富含载脂蛋白E（Apolipoprotein E, APOE）。当APPNEVs被健康神经元摄取后，其携带的APOE会通过抑制Rac1-N-WASP-Arp2/3信号通路，下调丝状肌动蛋白（F-actin）的聚合，从而损害成熟突触（特别是蘑菇型突触）的形成。体内外实验证实，抑制APOE可有效逆转APPNEV诱导的突触损伤。该研究为理解EV介导的AD神经退行性病变提供了新见解，并提示APOE是潜在的治疗靶点。
引言
阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）是一种进行性神经退行性疾病，是导致痴呆的主要原因，其特征包括认知障碍、记忆力下降和行为改变。随着全球老龄化人口的快速增长，AD的患病率持续上升。现有证据表明，突触损伤发生在AD的早期阶段，先于临床症状的出现。在成体和老年大脑中，突触形成和消除共存于动态平衡之中，而这种平衡的破坏导致了AD中的净突触损失。这种突触损伤破坏了神经元通讯，逐渐导致认知障碍。越来越多的证据表明，突触功能障碍是AD早期阶段的核心病理特征，其严重程度与认知下降的程度密切相关。鉴于AD认知功能障碍的进展性，一个关键问题是病变神经元如何影响健康神经元的突触。胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）已成为细胞间通讯的关键介质，作为多功能分子载体，在细胞之间运输生物活性物质，包括蛋白质、脂质和核酸，从而调节细胞信号通路。越来越多的证据表明EVs在调节AD病理过程中起着至关重要的作用。EVs可以直接将Tau蛋白和淀粉样蛋白-β（Aβ）转移至邻近或远处的神经元，对受体细胞产生神经毒性作用。除了直接递送毒性蛋白外，EVs还可以通过调节受体神经元内的细胞内信号通路间接加剧神经元损伤。因此，有理由假设EVs可能将突触损伤从受损神经元传播到健康神经元，从而引发跨细胞的损伤级联反应。
本研究利用APP/PS1转基因小鼠作为AD相关的Aβ病理模型，旨在探究AD神经元来源的EVs在介导突触损伤传播中的关键作用，并阐明其分子机制。
方法与材料
2.1 小鼠模型
实验使用了表达嵌合淀粉样前体蛋白（APPswe）和突变型早老素1（PS1-dE9）的双转基因APP/PS1小鼠以及野生型（Wild-type, WT）C57BL/6小鼠。原代神经元培养物来自胚胎第16-17天（E16-17）小鼠胚胎的海马和皮层。
2.4 原代神经元培养
按照改良方案从孕鼠中分离和培养神经元。在妊娠第16-17天对孕鼠实施安乐死。在无菌条件下，从胚胎中解剖脑组织，并小心去除脑膜。在解剖显微镜下分离海马和皮层，并将其转移至含有冷HBSS缓冲液的培养皿中。将解剖的组织转移至无菌离心管中，通过轻柔吹打解离成单细胞悬液。将神经元接种在预先涂有聚-D-赖氨酸的培养皿上，并在37°C、5% CO2的加湿培养箱中培养。每3天更换一半培养液以维持最佳的神经元活性。免疫荧光染色证实培养细胞具有高纯度的神经元特性。
2.5 胞外囊泡分离
使用差速超速离心法从WT或APP/PS1转基因小鼠原代皮层神经元的条件培养基中分离EVs。简而言之，将培养基在4°C下以500×g离心20分钟以去除死细胞，然后以2,000×g离心30分钟以去除细胞碎片。上清液进一步在4°C下以10,000×g离心30分钟以去除亚细胞结构。将所得上清液转移至超速离心管，并在4°C下以167,000×g超速离心4小时。将获得的EV沉淀重悬于PBS中，然后在相同条件下再次超速离心以获得纯化的EVs。最终，将含有EVs的沉淀重悬于无菌PBS中。所得源自APP/PS1小鼠的神经元EVs（APPNEVs）和源自WT小鼠的神经元EVs（WTNEVs）短期储存在4°C或长期储存在-80°C。
2.6-2.8 EVs表征
通过纳米流式细胞术、透射电子显微镜和免疫印迹法对WTNEVs和APPNEVs进行表征。结果显示，两者具有典型的“杯状”形态，直径约为100纳米，浓度相似，并且都表达经典的小EVs标志物（如ALIX、TSG101、CD81）。两者均未检测到小EVs阴性标志物Mitofilin，表明成功分离了高纯度的小EVs。
2.10 蛋白质组学分析
采用液相色谱-串联质谱法分析APPNEVs和WTNEVs之间的差异表达蛋白质。与WTNEVs相比，APPNEVs中有393种蛋白质表达上调。生物信息学分析表明，这些蛋白质很可能参与“突触发生信号通路”的激活。其中，载脂蛋白E（APOE）被鉴定为显著上调的关键蛋白。免疫印迹和免疫金标记透射电镜进一步证实APPNEVs携带更高水平的APOE，且APOE主要位于EVs表面。
2.12-2.13 免疫荧光与树突棘形态分析
用WTNEVs或APPNEVs处理培养14天的体外原代神经元48小时。通过免疫荧光染色和Western blot检测突触后蛋白PSD95和突触前蛋白Synaptophysin（SYP）的表达。用鬼笔环肽标记丝状肌动蛋白，通过共聚焦显微镜Z-Stack成像观察树突棘形态。根据头部与颈部直径比和长颈与颈部比，将树突棘分为四类：丝状伪足型、细型、粗短型和蘑菇型。其中蘑菇型代表成熟突触，其他类型代表未成熟突触。分析树突棘总密度及各类型比例。
2.14 体内立体定位注射
将APPNEVs、WTNEVs、APOE抑制剂EZ-482或其组合，立体定位注射到6月龄WT小鼠海马齿状回。48小时后，获取脑组织并进行免疫荧光染色，评估突触蛋白PSD95和SYP的表达变化。
2.15 统计分析
使用GraphPad Prism进行统计分析，数据以均值±标准误表示，采用单因素方差分析或非配对双尾t检验，p值小于0.05认为具有统计学意义。
结果
3.1 WT和APP/PS1神经元来源胞外囊泡的表征
从WT和APP/PS1转基因小鼠胚胎脑中分离神经元。通过多步超速离心方案从条件培养基中纯化出WTNEVs和APPNEVs。透射电镜显示两者均呈现小EVs典型的“杯状”形态，直径约为100纳米，无显著差异。纳米流式细胞术显示颗粒大小约为75纳米，浓度相似。两者均表达经典小EVs标志物ALIX、TSG101和CD81，且未检测到阴性标志物Mitofilin。结果表明，APPNEVs和WTNEVs在形态、大小、浓度和蛋白标志物表达上具有可比性。
3.2 APPNEVs抑制神经元突触的形成
首先，神经元对WTNEVs和APPNEVs的摄取无显著差异。用EVs处理神经元12、24和48小时，发现处理48小时后，与Vehicle（对照组）和WTNEVs处理组相比，APPNEVs显著下调了突触后蛋白PSD95的表达。免疫荧光染色也显示APPNEVs处理48小时后神经元PSD95荧光强度显著降低。同样，APPNEVs在48小时处理后也显著抑制了突触前蛋白SYP的表达。处理12或24小时未发现显著变化。LDH检测表明，EVs处理48小时未影响神经元活力，说明观察到的突触表型并非由一般细胞毒性引起。
树突棘形态分析表明，与Vehicle和WTNEVs组相比，APPNEVs显著降低了神经元树突棘的总数量。进一步分析发现，APPNEVs显著增加了未成熟粗短型突触的比例，而对丝状伪足型或细型未成熟突触的比例无影响。相反，APPNEVs显著降低了神经元中成熟蘑菇型突触的比例。成熟突触标记物Homer1的表达在APPNEVs处理后也显著降低。这些发现表明，APPNEVs损害神经元突触形成，特别是成熟突触的发育。
3.3 WTNEVs和APPNEVs的质谱蛋白质组学分析
LC-MS/MS蛋白质组学分析显示，与WTNEVs相比，APPNEVs中有393种蛋白质表达上调，其中包括12种显著上调的蛋白质，未检测到下调蛋白。对393个上调蛋白的生物信息学分析（IPA）表明，这些蛋白最可能参与“突触发生信号通路”的激活。对该通路中APPNEVs相关蛋白的进一步分析确定APOE是一个显著上调且差异表达显著的蛋白。Western blot分析证实，与WTNEVs相比，APPNEVs携带的APOE水平显著更高。免疫金标记TEM分析进一步显示，APPNEVs携带更高水平的APOE，且APOE主要位于EVs表面。这些发现表明，APPNEVs可能通过增强APOE蛋白的运输来参与调节神经元突触形成。
3.4 APPNEVs中的APOE促进神经元突触形成损伤
使用APOE抑制剂EZ-482来广泛抑制APPNEVs上APOE的活性。EZ-482处理不影响神经元对WTNEVs或APPNEVs的摄取，也不改变受体神经元中APOE受体（LRP1、LDLR、VLDLR）的表达水平。重要的是，EZ-482处理阻止了APPNEVs对神经元突触蛋白PSD95和SYP表达的下调。此外，EZ-482有效抑制了APPNEVs诱导的树突棘总数减少。EZ-482还阻断了APPNEVs诱导的神经元中成熟蘑菇型突触比例的下降，并阻止了APPNEVs诱导的未成熟粗短型突触比例的增加，而对细型或丝状伪足型突触无影响。在WTNEVs或WTNEVs+EZ-482组中，未检测到PSD95或SYP蛋白水平以及突触数量的变化。这些发现共同证明，APPNEVs携带的APOE介导了神经元突触形成损伤。
3.5 APPNEVs中的APOE通过下调F-actin聚合信号损害突触
已知各种形式的突触棘形成基于肌动蛋白细胞骨架的重塑，包括丝状肌动蛋白（F-actin）的成核和分支延伸。F-actin的分支和延伸由Arp2/3复合体调节。在神经元中，小GTP酶Rho家族蛋白（GDP-Rac1激活为GTP-Rac1）的激活进一步激活N-WASP，从而导致Arp2/3复合体的激活。这种激活促进肌动蛋白以约70°的角度分支，最终调节突触形成。为了研究APPNEVs是否通过破坏F-actin聚合信号来损害突触形成，用NSC23766（Rac1抑制剂）、Wiskostatin（N-WASP抑制剂）或CK666（Arp2/3复合体抑制剂）处理神经元。发现这三种抑制剂均显著下调了神经元突触蛋白PSD95的表达，其效果与APPNEVs处理相似。这表明APPNEVs可能通过下调神经元Rac1-N-WASP-Arp2/3信号通路来损害突触形成。
进一步的GTP-Rac1分析显示，APPNEVs降低了神经元中Rac1的GTP激活水平。重要的是，用APOE抑制剂EZ-482处理可消除APPNEVs诱导的GTP-Rac1下调。由于Arp2/3复合体的激活需要Arp2的磷酸化，研究还发现APPNEVs抑制了神经元中Arp2的磷酸化。同样，EZ-482处理阻止了APPNEVs诱导的Arp2磷酸化下调。为了进一步验证APPNEVs通过抑制F-actin聚合信号来损害突触形成，进行了挽救实验。发现用Rac1激活剂ML-099处理，可有效恢复APPNEVs诱导的Arp2磷酸化降低，表明重新激活Rac1通路可以逆转APPNEVs引起的下游信号抑制。此外，使用Jasplakinolide激活F-actin聚合，显著挽救了APPNEVs诱导的突触形成损伤。这些发现共同表明，APPNEVs中的APOE通过抑制神经元中Rac1-N-WASP-Arp2/3介导的F-actin聚合信号通路来抑制突触棘的形成。
3.6 APPNEVs中的APOE诱导小鼠脑内神经元突触损伤
为了在体内动物模型中进一步验证体外发现，利用立体定位脑部注射将EVs递送到小鼠海马区，并通过脑冰冻切片检测神经元突触变化。如图6B和6C所示，与Vehicle和WTNEVs处理组相比，APPNEVs显著下调了突触蛋白PSD95和SYP的表达。值得注意的是，用APOE抑制剂EZ-482处理后，这种下调被显著抑制。相比之下，WTNEVs和WTNEVs+EZ-482立体定位注射组未显示PSD95或SYP表达的显著变化，表明WTNEVs和WTNEVs+EZ-482不会损害突触蛋白水平。这些体内结果证明，APPNEVs通过携带APOE介导健康神经元的突触损伤，从而加速AD的进展。
结论
本研究系统阐明了在阿尔茨海默病进程中，源自病变神经元（APP/PS1模型）的胞外囊泡（APPNEVs）在传播突触损伤中的关键作用及其分子机制。核心发现是，APPNEVs富含载脂蛋白E（APOE）。当这些囊泡被健康神经元摄取后，其表面的APOE会干扰神经元内的Rac1-N-WASP-Arp2/3信号轴，抑制丝状肌动蛋白（F-actin）的聚合。这一过程最终导致成熟突触（特别是蘑菇型棘）形成受阻，突触总数减少，突触形态向未成熟状态偏移。通过药理学手段抑制APOE（使用EZ-482）或直接激活下游的Rac1或F-actin聚合，均可有效逆转APPNEVs诱导的突触损伤，这在体外培养神经元和体内小鼠海马注射模型中均得到证实。
该研究不仅揭示了EVs作为“毒性信使”在AD病理传播中的新角色，更重要的是，将APOE定位为这一破坏性过程中的核心效应分子和治疗干预的潜在靶点。这为理解AD早期突触丢失的细胞间机制提供了全新视角，并为开发旨在保护突触功能、延缓疾病进展的新型治疗策略奠定了重要的理论基础。
