《Journal of Extracellular Vesicles》：A Unique Intercellular Feedforward Loop From HK1 to TGF-β1 Promotes the Progression of Hepatocellular Carcinoma
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本综述揭示了肝星状细胞(HSC)与肝癌细胞(HCC)间独特的细胞通讯新机制。激活的HSC通过大细胞外囊泡(lEV)递送己糖激酶1(HK1)至HCC细胞，后者通过促进己糖胺生物合成途径(HBP)和转化生长因子-β1(TGF-β1)的N-糖基化，增强TGF-β1分泌，进而进一步激活HSC，形成一个恶性前馈循环，驱动肝癌(HCC)发展与纤维化肿瘤微环境(TME)的建立。靶向此循环为HCC治疗提供了新策略。
文章内容
1 引言：HCC、HSC与细胞间通讯的复杂关系
肝细胞癌(HCC)是一种高死亡率的恶性肿瘤，通常在肝纤维化或肝硬化的背景下发生。肝星状细胞(HSC)是肝脏纤维化过程中的主要细胞类型。在健康肝脏中，HSC处于静息状态。当肝损伤发生时，静息HSC会转化为活化的肌成纤维细胞样表型，其特征是增殖加速、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达上调以及细胞外基质(ECM)产生增加。尽管研究表明HSC相关的纤维化与HCC发展有关，但其潜在机制在很大程度上仍不明确。近年研究发现，HSC与HCC细胞之间的相互作用对HCC进程至关重要，提示HSC活化可能是驱动HCC恶性进展的关键因素之一。
细胞外囊泡(EVs)是包裹在脂质双层膜中的颗粒，作为细胞间通讯的关键介质，将特定物质从供体细胞传递到受体细胞。根据直径大小，EVs可分为小于200纳米的小细胞外囊泡(sEV)和大于200纳米的大细胞外囊泡(lEV)。本团队先前研究发现，在肝纤维化过程中，活化的HSC会通过lEV分泌己糖激酶1(HK1)。HK1是催化糖酵解第一步的关键酶。这些含有HK1的lEV被HCC细胞选择性摄取，从而加速肿瘤细胞的糖酵解并促进肿瘤生长。
转化生长因子-β(TGF-β)是一个调节性细胞因子家族，在发育和组织稳态中调控多种过程。其中TGF-β1是含量最丰富、研究最广泛的亚型，是已知最强的促纤维化因子之一。在HCC发病过程中，TGF-β扮演双重角色：在癌前阶段作为肿瘤抑制因子，而在HCC发展过程中则转化为致癌因子，促进肿瘤转移、血管侵袭和血管生成，并维持炎症性、促纤维化和免疫抑制的肿瘤微环境。
HK负责催化葡萄糖磷酸化，是葡萄糖代谢的起始步骤。哺乳动物中HK家族有四个成员(HK1–4)，其中HK1对葡萄糖的亲和力最高。由于HCC细胞自身几乎不表达HK1，长期以来HK1在HCC中的作用被忽视。本研究揭示了HSC来源的lEV HK1如何增强HCC细胞分泌TGF-β1，进而激活HSC，形成一个加剧HCC进展的前馈循环。
2.1 HCC细胞糖代谢调控HSC与HCC细胞的细胞间通讯
葡萄糖代谢重编程是HCC细胞的典型特征，而HCC细胞与HSC之间的相互作用被认为是支持HCC进展的关键因素。然而，HCC细胞的葡萄糖代谢重编程是否调控其与HSC的相互作用尚不清楚。对临床HCC患者单细胞RNA测序(scRNA-seq)数据的分析表明，HCC细胞中糖代谢能力较高的样本，其HSC中
（编码α-SMA）的表达也较高，提示HCC细胞的糖代谢可能与HSC活化相关。体外实验进一步证实了这一关联。当人HSC细胞系LX-2在HCC细胞系Huh7的条件培养基中培养时，会转化为活化的形态。在Huh7细胞中过表达HK1（糖酵解起始步骤的关键酶）可显著增强其条件培养基激活LX-2细胞的能力。相反，用干扰葡萄糖代谢的抑制剂2-脱氧-D-葡萄糖(2-DG)处理Huh7细胞后，其条件培养基失去激活LX-2细胞的能力。类似的現象也在其他HCC细胞系（如HepG2、Hepa1-6）中被观察到。这些结果一致表明，HCC细胞的葡萄糖代谢在促进HCC细胞与HSC的细胞间通讯、进而激活HSC方面起着关键作用。
HCC细胞自身通常不表达HK1。本团队先前报道，HK1在HSC中高表达，且活化的HSC可通过lEV将HK1递送至HCC细胞，从而增强HCC细胞的葡萄糖代谢。为了探究lEV HK1处理后的HCC细胞是否对诱导HSC活化有更显著的影响，研究人员从活化的对照LX-2细胞或HK1敲低的LX-2细胞中分离了lEV。纳米流式细胞术测量显示，从HSC分离的lEV直径大约在200至600纳米之间。透射电镜观察结果与此一致。实验证实HK1存在于对照LX-2细胞来源的lEV中，而在HK1敲低细胞来源的lEV中检测不到。蛋白酶K消化和碘克沙醇密度梯度离心(DGC)实验证实HK1是lEV的内部货物，而非分泌蛋白。
用对照LX-2细胞来源的lEV孵育Huh7细胞，可显著提高Huh7细胞中HK1的蛋白水平，证实了lEV HK1被成功摄取。随后收集Huh7细胞的条件培养基进一步培养LX-2细胞。结果显示，经lEV孵育的Huh7细胞的培养基（而非经HK1敲低lEV孵育的Huh7细胞的培养基）表现出更强的激活LX-2细胞的能力。此外，HCC细胞诱导的LX-2细胞活化伴随着LX-2细胞分泌lEV HK1的增加。这表明HK1通过lEV从活化的HSC递送至HCC细胞，随后又增强了HCC细胞激活HSC的能力，从而在HSC与HCC细胞之间建立了一个前馈调控循环。
对临床HCC样本scRNA-seq的进一步分析显示，HSC中
的表达水平与的表达水平呈正相关，这与上述发现一致。此外，这种HK1表达与HSC活化的关联仅在HCC样本中明显，在正常肝组织中则未观察到，表明HCC细胞的存在对HK1介导的HSC活化至关重要。在LX-2细胞中敲低HK1并不影响其自身被TGF-β1或HCC细胞条件培养基激活，这突显了HSC与HCC细胞间细胞通讯在促进HSC活化中的重要性。2.2 HK1促进HCC细胞分泌TGF-β1以激活HSC
TGF-β通路是激活HSC最显著的促纤维化通路之一。为阐明为何经HSC来源的lEV HK1孵育的HCC细胞更能激活HSC，研究人员首先分析了正常肝组织和HCC样本的scRNA-seq数据。在HCC样本中，表达较高的HSC，其TGF-β通路活性也高于表达较低的HSC；但在正常肝组织中未观察到这种相关性。结合HK1在HSC中的表达不影响HSC自身Smad3磷酸化（TGF-β信号通路活性的既定标志物）的发现，可以推断表达HK1的HSC与HCC细胞之间的细胞通讯对于增强HSC中TGF-β通路活性至关重要。
在TGF-β亚型中，TGF-β1是HCC细胞表达的主要亚型。实验证实，TGF-β1在Huh7细胞的条件培养基中清晰可检测，且HK1过表达可显著增加其分泌。类似现象也在小鼠Hepa1-6细胞中被观察到，其中HK1过表达细胞分泌的TGF-β1水平与肿瘤相关巨噬细胞(TAM)这种已知的TGF-β1分泌型免疫细胞相当。考虑到HCC细胞在肿瘤组织中的丰度，其TGF-β1分泌可能对HSC活化有重要贡献。Huh7细胞的条件培养基或其与LX-2细胞的transwell共培养，均能显著增强LX-2细胞中TGF-β信号通路活性和α-SMA表达，且当Huh7细胞中过表达HK1时，此效应被进一步放大。用TGF-β1中和抗体处理可有效抑制LX-2细胞在Huh7细胞条件培养基或共培养刺激下的TGF-β信号通路活化和α-SMA表达。这些发现证实了HK1诱导的HCC细胞分泌TGF-β1是连接HCC细胞与HSC活化的关键介质。
鉴于活化的HSC通过lEV分泌HK1，研究进一步探究了HSC来源的lEV HK1是否在促进HCC细胞分泌TGF-β1中发挥作用。用活化的对照或HK1敲低LX-2细胞来源的lEV孵育Huh7细胞，结果显示lEV介导的HK1递送至Huh7细胞与Huh7细胞分泌TGF-β1增强密切相关。HK1的棕榈酰化对其从HSC分泌至关重要，HK1 6CS突变体（其中HK1的六个半胱氨酸残基突变为丝氨酸）会损害其通过lEV分泌，但不影响其酶活性。用HK1过表达LX-2细胞来源的lEV（而非过表达HK1 6CS突变体的lEV）孵育Huh7细胞，会导致Huh7细胞中HK1蛋白水平升高和随后的TGF-β1分泌增加。这种lEV HK1诱导的TGF-β1分泌在其他HCC细胞系（包括HepG2、HLF和小鼠Hepa1-6）中也得到证实。
HK1和HK2都是对葡萄糖具有高亲和力的己糖激酶。实验表明，在Huh7细胞中过表达HK2也能增加TGF-β1分泌，提示己糖激酶介导的葡萄糖代谢在促进TGF-β分泌方面具有普遍作用。然而，HK1由LX-2细胞通过lEV分泌，而HK2在基础状态或HCC细胞活化的LX-2细胞的lEV中均检测不到。HCC细胞主要表达HK2，HK1在基础条件下几乎检测不到，但在与对照LX-2来源的lEV孵育后，HK1在HCC细胞中可清晰检测到。相反，与LX-2来源的lEV孵育并未改变这些细胞中的HK2水平。为评估内源性HK2与lEV递送的HK1对HCC细胞TGF-β1分泌的相对贡献，研究人员评估了对照和HK2敲低Huh7细胞中lEV HK1诱导的TGF-β1分泌。结果显示，lEV HK1使TGF-β1分泌增加约2-3倍，而敲低HK2使TGF-β1分泌减少约1/3。重要的是，lEV处理在HK2敲低细胞中仍能显著增强TGF-β1分泌。这些结果表明，lEV HK1对HCC细胞分泌TGF-β1的贡献远大于内源性HK2。总之，来自活化HSC的lEV HK1促进了HCC细胞分泌TGF-β1，从而建立了一个进一步激活HSC的正反馈循环。
2.3 HK1促进pro-TGF-β1的N-糖基化以增强TGF-β1分泌
为探究HK1促进HCC细胞分泌TGF-β1的机制，研究人员对经HSC来源lEV处理的Huh7细胞进行了RNA测序(RNA-seq)。基因集富集分析(GSEA)显示，经LX-2来源lEV处理的Huh7细胞中，糖酵解通路被上调，而经HK1敲低lEV处理的细胞中该通路被下调。通过对差异表达基因进行京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析，鉴定出124条在lEV处理的Huh7细胞中富集的通路。N-聚糖生物合成通路是22条重叠通路之一，该通路用于合成N-聚糖，可进一步与蛋白质连接进行N-糖基化。由于已知pro-TGF-β1会发生N-糖基化，研究人员推测N-聚糖生物合成通路可能在HCC细胞分泌TGF-β1中发挥作用。GSEA进一步显示，与对照Huh7细胞相比，lEV处理的Huh7细胞中N-糖基化通路显著上调；而与经HK1敲低HSC来源lEV孵育的Huh7细胞相比，该通路则下调。此外，在Huh7细胞中过表达HK1足以正向调控糖酵解、N-聚糖生物合成通路和N-糖基化通路。对癌症细胞系百科全书(CCLE)RNA-seq数据的分析也表明，N-聚糖生物合成通路在HK1表达较高的HCC细胞系中显著富集。这些结果表明，HK1表达升高的HCC细胞可能具有更强的N-聚糖合成和N-糖基化能力。因此，HSC来源的HK1向HCC细胞的转移可能调控TGF-β的N-糖基化和分泌。
一系列实验验证了这种可能性。在Huh7细胞中，用活化的LX-2细胞来源的lEV孵育或过表达HK1，可诱导pro-TGF-β1对应的条带（用*标记）发生显著上移（用箭头标记）。然而，用PNGase F（一种催化切割N-连接寡糖的糖苷酶）孵育可消除这种上移，表明上移的条带代表pro-TGF-β1的N-糖基化形式。相反，来自HK1敲低LX-2细胞的lEV几乎不诱导任何pro-TGF-β1 N-糖基化。类似地，来自表达Flag-HK1 6CS的LX-2细胞的lEV（其中HK1在lEV中检测不到）失去了促进pro-TGF-β1 N-糖基化的能力。此外，用活化的对照LX-2细胞（而非HK1敲低LX-2细胞）来源的lEV孵育，会导致Huh7细胞中pro-TGF-β2和pro-TGF-β3的上移，这些上移可通过PNGase F孵育消除。但由于TGF-β2和TGF-β3在HCC细胞中表达水平相对较低，研究人员认为TGF-β1是受lEV HK1调控的主要亚型。
据报道，pro-TGF-β1的Asn82、Asn136和Asn176位点会发生N-糖基化。对这些残基的突变研究表明，每个残基都对pro-TGF-β1的N-糖基化有贡献，同时突变所有三个残基(TGF-β1 3NQ)可完全消除其在Huh7细胞中的N-糖基化。相应地，将Flag-TGF-β1 3NQ重新导入TGF-β1敲低的Huh7细胞，未能恢复Huh7细胞的TGF-β1分泌或Huh7细胞激活LX-2细胞的能力。这些发现表明，TGF-β1的N-糖基化对其从HCC细胞分泌至关重要，从而促进HSC活化。在Huh7细胞中过表达HK1进一步增强了pro-TGF-β1（而非pro-TGF-β1 3NQ）的N-糖基化。随后，HK1过表达增加了表达Flag-TGF-β1的Huh7细胞（而非表达Flag-TGF-β1 3NQ的Huh7细胞）的TGF-β1分泌。总之，这些结果表明，HSC来源的HK1促进了HCC细胞中TGF-β1的N-糖基化，从而增强了其分泌。
2.4 HK1重编程HBP代谢以促进TGF-β1 N-糖基化
研究人员进一步探究了HK1诱导pro-TGF-β1 N-糖基化的机制。在Huh7细胞中过表达HK1（而非其酶活性丧失的突变体HK1D657A）促进了TGF-β1 N-糖基化和分泌，表明HK1的葡萄糖磷酸化活性对其TGF-β1 N-糖基化功能是不可或缺的。用几种葡萄糖分解代谢抑制剂处理Huh7细胞。结果显示，抑制葡萄糖分解代谢的2-DG显著抑制了HK1诱导的pro-TGF-β1 N-糖基化和TGF-β1分泌。另一方面，用6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸(DON)（谷氨酰胺-果糖-6-磷酸转氨酶1[GFAT1]的抑制剂，GFAT1是己糖胺生物合成途径(HBP)的限速酶）刺激也会阻碍pro-TGF-β1的N-糖基化和TGF-β1分泌。当Huh7细胞用活化的HSC来源的lEV处理时，也观察到类似现象。总之，这些发现表明，葡萄糖代谢向HBP的分流对HK1诱导的TGF-β1分泌至关重要。
使用同位素标记的葡萄糖([U-13C]葡萄糖)，研究人员证明，来自对照HSC（而非HK1敲低HSC）的lEV显著增加了HBP通量以产生GlcNAc-1-P和UDP-GlcNAc。UDP-GlcNAc随后可用于聚糖合成。研究人员使用麦胚凝集素(WGA)评估lEV孵育后HCC细胞中的整体聚糖水平。结果表明，lEV HK1提高了Huh7细胞中的整体聚糖丰度。聚糖是蛋白质N-连接和O-连接糖基化所必需的。只有当N-糖基化被衣霉素(Tuni)抑制时，由HK1或HSC来源lEV诱导的pro-TGF-β1 N-糖基化以及TGF-β1的分泌才会减少。相反，蛋白质O-糖基化抑制剂苯基-2-乙酰胺基-2-脱氧-α-d-吡喃半乳糖苷(BADGP)对HK1或lEV诱导的pro-TGF-β1 N-糖基化或TGF-β1分泌没有影响。总之，这些结果证明，HK1通过加速HBP的代谢来促进TGF-β1的N-糖基化，从而促进TGF-β1分泌。此外，来自对照LX-2细胞（而非HK1敲低LX-2细胞）的lEV也显著增强了另一种已知会发生N-糖基化的蛋白质GP73的N-糖基化。因此，HSC来源的lEV HK1似乎促进了HCC细胞中整体N-糖基化水平。
在transwell共培养系统中进一步证明了HK1重编程HBP和TGF-β1分泌的结果。尽管HK1过表达的Huh7细胞表现出很强的诱导LX-2细胞α-SMA表达和TGF-β信号通路活化的能力，但用2-DG、DON或Tuni处理显著削弱了Huh7细胞的这种能力。因此，上述结果表明，HK1加速了HCC细胞中葡萄糖代谢向HBP的流动，从而增强了TGF-β1的N-糖基化和分泌。
2.5 lEV HK1和TGF-β1介导的细胞间通讯加剧HCC进展
lEV HK1和TGF-β1介导的细胞间通讯在几种小鼠模型中得到了进一步验证。首先，在Hepa1-6细胞来源的异种移植原位模型中，过表达HK1促进了HCC生长，这与Ki67（肿瘤细胞增殖的标志物）表达升高密切相关。值得注意的是，HSC（α-SMA阳性细胞）中的p-Smad3信号显著增强，表明HCC细胞中HK1过表达激活了HSC中的TGF-β信号通路。因此，HSC中更高的TGF-β信号活性导致了肿瘤组织内HSC的扩增，表现为α-SMA阳性细胞数量增加。
其次，在对照或HK1条件性敲除小鼠中，使用表达Flag-TGF-β1和Flag-TGF-β1 3NQ的Hepa1-6细胞进行原位移植。与将表达Flag-TGF-β1的Hepa1-6细胞原位植入< />f/f>小鼠的对照组相比，条件性敲除HSC中的HK1（< />f/f; Gfap-Cre>小鼠）或损害TGF-β1 N-糖基化（表达Flag-TGF-β1 3NQ的Hepa1-6细胞）均显著延缓了肿瘤生长和Ki67表达，并伴随着HSC中p-Smad3信号减弱、HSC活化减弱以及肿瘤组织中HK1蛋白水平降低。此外，从相应异种移植获得的肿瘤组织清楚地表明，HCC细胞中TGF-β1的N-糖基化在HSC中条件性敲除HK1或肿瘤细胞中TGF-β1 3NQ突变后均大大减少。在< />f/f; Gfap-Cre>小鼠中，TGF-β1突变不能进一步抑制肿瘤生长、HSC活化和TGF-β1糖基化。这些发现与HK1在HSC中对于促进HCC细胞中TGF-β1 N-糖基化及其后续分泌的重要作用相符。
先前研究报道，在某些情况下，小鼠除了在HSC中诱导重组外，还会在胆管细胞中诱导重组，而小鼠最近被发现对HSC中的重组更具特异性和效率。研究人员进一步在驱动的条件性敲除小鼠中进行了原位移植。结果一致显示，驱动的HSC中HK1条件性敲除显著延缓了肿瘤生长，并伴随着肿瘤内HSC中p-Smad3信号减弱、HSC活化减弱、HK1蛋白水平降低和TGF-β1 N-糖基化减少。因此，所有这些结果一致证明，由lEV HK1和TGF-β1介导的HCC细胞与HSC之间的前馈循环在加剧HCC进展中起着关键作用。
接下来，研究人员建立了< />loxp-stop-loxp-HK1>（即）和< />loxp-stop-loxp-Hk1 6CS>（即）转基因小鼠，以阐明HSC来源的lEV HK1的功能。通过与小鼠杂交，获得了或< />6CS; Gfap-Cre>小鼠，其中HK1或HK1 6CS的mRNA和蛋白在HSC中显著过表达。研究发现，HSC中过表达HK1不仅提高了肿瘤组织中的HK1蛋白水平，还激活了HSC中的TGF-β信号，促进了HSC活化，从而促进了肿瘤生长。相反，HSC中过表达HK1 6CS（其不能通过HSC的lEV分泌）则没有表现出这种效应。总之，这些结果表明，HSC与HCC细胞之间通过分别释放lEV HK1和TGF-β1进行的细胞间通讯可以形成一个促进HCC进展的恶性循环。
2.6 HSC与HCC细胞间的细胞间通讯导致HCC患者不良预后
最后，研究人员阐明了HSC与HCC细胞之间的前馈循环在临床HCC样本中的病理相关性。利用临床HCC组织的空间转录组学数据，验证了通过HSC与HCC细胞间细胞通讯促进HSC活化的现象。肿瘤组织中的HSC主要分为两个簇（HSC_0和HSC_1）。与HSC_1簇细胞相比，HSC_0簇细胞高表达
，表明HSC_0簇细胞处于高度活化状态。对组织中空间细胞图谱的观察表明，HSC_0簇细胞浸润在肿瘤区域，而HSC_1簇细胞
