《Journal of Neurochemistry》：Lack of Structural Change in Olfactory Circuitry Following Fecal Microbiome Transplant From Donors Subjected to Diet-induced Obesity
编辑推荐：
本综述探讨了高脂饮食（MHF）与肠道微生物组失调对嗅觉系统结构的影响。研究发现，虽然MHF饮食可导致供体小鼠肥胖、代谢功能障碍和嗅觉神经元（OSN）及嗅小球损伤，但将MHF供体的粪便微生物群移植（FMT）到正常饮食的受体小鼠后，并未诱发受体小鼠的嗅觉回路（以Olfr160嗅小球体积为指标）发生结构性变化。这表明，单纯由MHF引起的肠道菌群失调，不足以导致嗅觉回路缺陷，而饮食诱导的肥胖及其相关的代谢异常才是驱动嗅觉系统功能丧失和结构改变的关键因素。
引言
肥胖是一种以全身性低度炎症和过度脂肪堆积为特征的慢性疾病，会增加患2型糖尿病和代谢综合征的风险。肥胖由能量失衡驱动，而观察到的化学感觉变化可能进一步导致饮食行为失调。众所周知，肥胖、不健康饮食和代谢失衡会对我们的化学感觉系统（包括嗅觉和味觉）的结构和功能产生有害影响。饮食诱导的肥胖与味蕾和嗅觉感觉神经元（OSN）的丢失，以及投射到嗅球的轴突密度减少有关。在嗅觉和味觉中，高脂饮食的消耗与炎症增加、细胞新生减少和细胞死亡增加相关。
有趣的是，在嗅觉系统中，归因于饮食诱导的肥胖的嗅觉感觉神经元丢失，在恢复低脂饮食后不会恢复。高脂饮食导致嗅球内与mRNA代谢过程、DNA损伤反应和DNA修复相关的基因上调。此外，经历饮食诱导的肥胖的小鼠表现出电嗅觉图振幅降低、嗅球输出神经元动作电位发放的不规则兴奋性以及对气味分子辨别能力降低。在一个等热量配对喂养模型中，即使高脂喂养的小鼠保持瘦削，嗅觉感觉神经元的丢失仍然持续，这表明神经元丢失可由饮食本身独立于肥胖而驱动。
饮食是肠道微生物组组成的主要调节因素，而肠道微生物组在全身生理学中发挥作用。肥胖会显著破坏肠道微生物组，诱导肠道微生物组失调。粪便微生物群移植（FMT）实验表明，肠道微生物组调节体脂沉积，以及行为、神经炎症和神经元丢失。由于肠道微生物组足以传播与肥胖和高脂饮食相关的负面健康结果，我们想知道从肥胖供体转移的肠道微生物组是否会将损伤传播给原本健康的受体小鼠的嗅觉系统。
为此，我们测试了来自高脂喂养小鼠的粪便微生物群移植如何引发新陈代谢、身体成分和嗅觉回路的变化。供体材料取自维持适度高脂饮食5个月的雄性和雌性小鼠。雄性小鼠表现出饮食诱导的肥胖、葡萄糖耐受不良、脂肪堆积增加和代谢功能障碍。雌性小鼠对饮食诱导的肥胖具有抵抗力，表现出葡萄糖敏感性，但身体成分发生了变化。将粪便物质移植到对照喂养的受体小鼠中，引起了雄性小鼠微生物群的预期变化，但在8周的暴露过程中，雄性或雌性小鼠的体重、葡萄糖耐量或脂肪含量均未发生持续变化。利用光片显微镜研究了Olfr160嗅小球的体积，因为之前有报道称饮食诱导的肥胖后，Olfr160嗅觉感觉神经元和相关投射会丢失。尽管在雄性小鼠中观察到了肠道菌群失调，但两种性别的受体小鼠的Olfr160嗅觉小球大小均未减小。总的来说，这些数据表明，在没有过量膳食脂肪或肥胖的情况下，失调的肠道微生物组不足以诱导代谢和嗅觉解剖结构的变化。
材料与方法
我们的研究设计未预先注册为临床试验。所有动物实验均经佛罗里达州立大学机构动物护理和使用委员会批准。小鼠维持在12小时反向光/暗循环下，以便在暗周期进行实验。动物在佛罗里达州立大学动物房中单独饲养，可随意获取食物和水，除非另有说明。小鼠维持在对照脂肪饲料（CF，含有13.6% kcal脂肪）或适度高脂肪饲料（MHF，含有31.8% kcal脂肪）上。供体动物在出生后第28天被任意分配到其中一种饮食，并持续维持5个月。受体小鼠在5-6月龄接受抗生素耗竭前，断奶后一直维持CF饮食。
所有供体小鼠均为C57BL6/J背景，来自实验室先前使用的两种不同品系，已知对维持MHF饮食有相同反应，即野生型小鼠和具有嗅觉受体160（Olf160）报告基因的小鼠。受体小鼠含有相同的嗅觉受体160报告基因，但使用tauGFP而非tauLacZ，以便通过免疫标记实现溶剂清除器官三维成像（iDISCO）进行光学可视化。本研究总共使用了83只小鼠（40只雄性，43只雌性），并任意分配到CF饮食或MHF饮食。其中24只小鼠接受了粪便微生物群移植，59只小鼠中的19只作为供体。
每周收集供体小鼠的体重。在饮食维持的最后2周，小鼠接受粪便采样、EchoMRI扫描、代谢表型分析、腹腔内葡萄糖耐量测试，然后被处死进行死后组织分析。受体小鼠接受抗真菌治疗、抗生素治疗，然后接种供体材料。在移植后3周收集粪便样本以确认粪便细菌的耗竭和肠道细菌的再接种。在最后2周（移植后7-8周），小鼠接受EchoMRI扫描、腹腔内葡萄糖耐量测试，然后被处死进行死后组织分析。
通过EchoMRI-900扫描测量小鼠的瘦肉和脂肪质量。小鼠进行腹腔内葡萄糖耐量测试以确定糖尿病状态。将小鼠放入综合实验室动物监测系统（CLAMS）中进行代谢评估。收集小鼠的粪便样本用于肠道微生物组分析和移植。用抗生素混合液处理小鼠5-6天，然后在4天内每天施用供体材料。在粪便微生物群移植后，每周收集新鲜粪便颗粒用于非侵入性“加强剂”再接种。
死后，用酮胺和甲苯噻嗪混合物麻醉小鼠，通过心脏灌注进行放血。颅骨后固定3小时，然后在0.3M EDTA中脱钙。解剖死后脂肪组织沉积、肝脏和脾脏并称重。使用iDISCO+方案光学清除嗅球。在组织清除前，在配备尼康AZ Plan Fluor 5×物镜的尼康AZ100M体视镜上获取嗅球的全标本图像。使用光片显微镜对iDISCO清除的嗅球进行成像。在Fiji中使用Measure Stack插件估算嗅小球体积。
使用QIAamp PowerFecal Pro DNA试剂盒从储存的粪便颗粒中提取DNA。提取的DNA由佛罗里达州立大学生物科学系分子核心实验室进行处理，用于16S v4区域扩增子测序。在QIIME2管道中处理细菌序列，并使用Greengenes2数据库分配分类单元。将数据导入MicrobiomeAnalyst 2.0进行α和β多样性分析。α多样性用Chao 1指数和香农指数评估，β多样性用布雷-柯蒂斯相异指数评估。
使用格拉布斯检验在所有数据集中识别异常值，然后进行后续统计分析。使用Fmax检验确定数据是否不符合方差齐性。如果数据具有不等方差，则进行带韦尔奇校正的t检验。对于在时间上重复采样的实验，应用双向重复测量方差分析或混合效应模型分析，以时间和饮食/供体为因素，并进行?idák多重比较检验。将标准化粪便DNA浓度用韦尔奇方差分析进行检验。先验设定α为0.05。
结果
雄性小鼠维持适度高脂饮食后体重增加且葡萄糖清除受损
CF和MHF处理的雄性小鼠的平均每周体重存在显著差异。体重的差异从饮食维持的第10周开始，并在研究期间持续存在。与雄性小鼠相反，雌性小鼠在体重变化方面对饮食有相当的抵抗力。在第20周进行的测量表明，雄性MHF喂养的小鼠比CF喂养的对照小鼠体重显著增加，而雌性小鼠则没有。雄性小鼠因MHF饮食导致的体重增加也与葡萄糖清除受损有关。当进行腹腔内葡萄糖耐量测试时，选择性维持MHF饮食的雄性小鼠在血糖方面显示出饮食的主要影响。空腹血糖水平在维持改良饮食与对照的雄性或雌性小鼠之间没有差异。对曲线下面积的分析表明，雄性MHF喂养的小鼠葡萄糖清除能力显著较差，而雌性小鼠则没有。
MHF喂养的小鼠脂肪量增加，但瘦肉量没有变化，且与性别无关
身体成分在EchoMRI扫描仪中测量，以确定MHF雄性组体重升高是由于瘦肉或脂肪量增加，还是两者结合所致。有趣的是，当维持MHF饮食时，雄性和雌性小鼠都表现出身体成分的改变。虽然瘦肉量没有变化，但雄性和雌性MHF喂养的小鼠脂肪量均显著增加。然后进行死后脂肪组织解剖，以评估脂肪是否优先储存在不同区域。对于雄性小鼠，在所有收集的脂肪来源中，脂肪组织沉积均升高，包括肩胛间棕色脂肪组织、性腺白色脂肪组织、皮下白色脂肪组织和腹膜后白色脂肪组织。而对于雌性小鼠，每个脂肪来源的沉积都有所升高，但均未达到统计学显著性标准。
接受MHF饮食挑战的小鼠表现出代谢功能障碍
接下来对小鼠进行综合实验室动物监测系统表型分析，以确认在将其粪便物质转移给受体小鼠之前，MHF饮食引起的预期新陈代谢和燃料利用变化。数据显示，维持MHF饮食的雄性小鼠在耗氧量方面出现了预期下降，这归因于暗周期中段的减少，并反映在12小时暗周期消耗量显著降低。雌性小鼠在维持MHF饮食时表现出耗氧量适度升高。对于雄性小鼠，MHF饮食对暗周期和明周期的产热消耗均有主要影响。呼吸交换比值在大部分暗周期也显著降低，延伸到明周期开始，表明雄性MHF小鼠对脂肪的燃料利用率更高。在雌性小鼠中也观察到了产热和呼吸交换比值的类似轻微趋势，但12小时平均值在饮食间没有差异。两种性别小鼠的运动活动在暗周期均未显示出饮食的主要影响或时间与饮食的交互作用。
维持MHF饮食的小鼠表现出肠道微生物组失调
经过5个月的饮食维持，适度高脂肪喂养的雄性和雌性小鼠的肠道微生物组组成出现了脂肪饮食消耗和饮食诱导的肥胖特有的失调。使用Chao 1指数和香农指数评估α多样性。维持适度高脂肪饮食的雄性和雌性小鼠在两项指标上均表现出α多样性降低。同样，饮食组在布雷-柯蒂斯相异性指数上表现出不同的β多样性。在门水平，喂食适度高脂肪饮食的雄性和雌性小鼠表现出厚壁菌门I和放线菌门的相对丰度升高，拟杆菌门和弯曲菌门A的相对丰度降低，疣微菌门的相对丰度未变。喂食脂肪饮食的雄性小鼠表现出厚壁菌门A 368345的相对丰度降低，而雌性小鼠没有变化。在科水平，雄性和雌性小鼠均表现出丹毒丝菌科和双歧杆菌科的丰度升高，以及毛螺菌科、鼠杆菌科、乳杆菌科和拟杆菌科的丰度降低。维持MHF饮食的雄性和雌性小鼠均表现出鼠杆菌科成员Lepagella muris A、Duncaniella muris、Duncaniella muricolitica、Duncaniella dubosii、CAG-873 sp011959565和Muribaculum intestinale的相对丰度降低。此外，与CF喂养的对照相比，高脂喂养的小鼠还表现出Parasutterella muris和Prevotella sp902776665的相对丰度降低，以及Bifidobacterium 388775 sp.和Lactococcus A 346100 sp.的相对丰度升高。
从肥胖供体进行FMT后粪便DNA负荷和肠道细菌的变化
首先用抗真菌水处理粪便微生物群移植受体小鼠，以防止抗生素给药后真菌过度生长。提供随意饮用的载体水或抗真菌水的小鼠消耗水量相似。抗生素混合液处理降低了标准化的粪便DNA负荷。这些数据表明，抗生素耗竭后粪便DNA浓度显著下降，而FMT后DNA浓度升高。在抗真菌、抗生素和供体材料给药期间监测体重以监测动物健康状况。
与维持改良饮食的小鼠相反，FMT-MHF受体动物在α多样性上没有表现出降低，β多样性也没有差异。在门水平，移植没有引起任何相对丰度的变化。然而，在科水平，雄性FMT-MHF小鼠表现出丹毒丝菌科相对丰度增加和乳杆菌科相对丰度降低，与MHF喂养的供体动物相似。在科水平没有观察到其他相对丰度的差异。尽管总鼠杆菌科相对丰度没有变化，但与FMT-CF对照相比，FMT-MHF雄性受体小鼠表现出Duncaniella muris的相对丰度降低。
受体小鼠从肥胖供体接受FMT后体重、葡萄糖清除或身体成分缺乏变化
在接受来自CF和MHF维持的供体的粪便匀浆FMT后，每两周监测一次雄性和雌性受体小鼠的体重，并绘制为原始体重或从预处理基线的百分比变化。接受来自MHF维持供体的粪便移植的小鼠与FMT-CF对照相比，体重没有差异。当进行腹腔内葡萄糖耐量测试时，接受来自MHF维持供体的FMT的雄性和雌性受体小鼠在血糖方面均未显示出供体的主要影响或供体与时间的交互作用。空腹血糖水平在接受来自CF或MHF喂养供体的粪便物质的雄性或雌性小鼠之间没有差异。对曲线下面积的分析也显示，接受来自MHF喂养供体小鼠FMT的受体小鼠葡萄糖清除没有显著变化。身体成分分析显示，接受来自MHF喂养供体小鼠FMT的受体小鼠的总瘦肉或脂肪质量没有差异。死后组织收集显示，接受来自MHF喂养供体小鼠FMT的雄性受体小鼠皮下白色脂肪组织重量显著降低，其他脂肪组织库重量或器官重量没有差异。对于雌性小鼠，接受来自MHF喂养小鼠FMT的受体小鼠腹膜后白色脂肪组织重量显著升高，其他脂肪组织库重量或器官重量没有差异。
从肥胖供体进行FMT后缺乏嗅觉小球变化
固定灌注后，解剖嗅球并拍摄全标本图像，以测量侧方Olfr160嗅小球的面积。测量了嗅小球面积，FMT-MHF雄性或雌性受体小鼠的嗅小球面积没有显著减少。嗅球光学清除后，收集了侧方和内侧Olfr160嗅小球的体积测量值。接受来自MHF供体移植的小鼠的侧方或内侧嗅小球体积也没有显著减少。
讨论
据我们所知，这是第一项进行来自对照脂肪或适度高脂肪喂养小鼠的粪便微生物群移植的研究，旨在区分归因于过量膳食脂肪消耗的嗅觉结构变化与饮食诱导肥胖后与肠道微生物组相关的嗅觉结构变化。MHF喂养的小鼠表现出体重增加、葡萄糖耐受不良、脂肪量和肥胖增加以及代谢功能障碍，且存在性别二态性——在雄性小鼠中观察到饮食诱导的肥胖及相关代谢功能障碍的诱导，而雌性小鼠表现出对饮食诱导的肥胖的抵抗力。尽管在雌性小鼠中观察到这种抵抗力，但MHF喂养的两种性别小鼠都表现出大致相似的肠道微生物组失调。即使在维持MHF饮食后两性的α多样性降低、β多样性不同以及门和科水平的变化相似，但在雄性受体小鼠中观察到了两个科水平的微生物组变化。雄性FMT-MHF受体小鼠还表现出Duncaniella muris的相对丰度降低，这是鼠杆菌科的一个成员。FMT-MHF雄性小鼠的这种减少表明，饮食对肠道微生物组的影响成功地从高脂喂养动物的粪便物质传播给了雄性受体小鼠。因此，口服过量脂肪似乎会引起微生物组失调，但丹毒丝菌科的升高、乳杆菌科的减少以及Duncaniella muris的减少不足以减少嗅觉小球的大小，而嗅觉小球的大小对编码嗅觉信息至关重要，并且在饮食诱导的肥胖后会减少。
我们观察到，维持适度高脂肪饮食的雄性和雌性小鼠中，双歧杆菌科的相对丰度均升高。研究中使用的适度高脂肪饮食含有乳脂，这可能推动了高脂喂养动物中观察到的双歧杆菌科丰度升高。
我们研究的一个局限性是粪便样本收集的时间窗口较大。已知肠道微生物组表现出昼夜节律，这可能会增加我们研究中的变异性。为了尽量减少不同处理组和性别间粪便收集时间的影响，我们在单一时间点收集了所有饮食/供体组和性别的粪便样本。值得注意的是，虽然我们根据膳食脂肪含量描述研究饮食，但MHF饮食也可以被描述为“较低蛋白质”饮食。因此，我们观察到的饮食代谢和微生物效应可以解释为脂肪升高和蛋白质减少的综合结果。未来研究将受益于单一常量营养素组成不同的定制饮食，以分别阐明膳食脂肪升高和膳食蛋白质减少的影响。
我们之前已经证明，饮食诱导的肥胖或在瘦小鼠中消耗过量膳食脂肪会导致Olfr160嗅觉感觉神经元的数量及其向Olfr160嗅小球的轴突投射减少。饮食诱导的肥胖还会导致嗅球内神经元活动减少。值得注意的是，饮食诱导的肥胖、等热量喂养和来自肥胖供体的粪便微生物群移植都会导致炎症，然而，来自饮食诱导的肥胖供体的粪便微生物群移植在减少受体小鼠的嗅小球体积方面是无效的。我们假设，保留正常的轴突投射和相关的嗅小球体积以进行嗅觉信息编码可能需要免疫系统、葡萄糖稳态和肠道健康等多个系统的协调——并且只有在不止一个系统受到干扰时才会出现回路结构的完全丧失。仅肠道微生物群的变化不足以改变解剖结构。经过20周的慢性高脂肪饮食维持，过量膳食脂肪也可能与脂毒性有关，这可能影响嗅觉突触的发育和维持，但在消耗对照脂肪的FMT-MHF受体动物中则不存在。另一种解释是，我们之前关于饮食诱导的肥胖的挑战发生在断奶年龄，而粪便微生物群移植是作为成年小鼠进行的。有可能围绕从哺乳到固体食物过渡的发育关键窗口，为暴露于MHF的供体小鼠的这些回路提供了更大的可塑性。我们的受体小鼠在通过粪便微生物群移植获得改变的微生物群时为6月龄，这是嗅觉小球图谱可塑性可能较低的时期。衰老也会导致嗅觉感觉神经元数量减少，肥胖对这些结构与潜在损伤机制、炎症或细胞更新变化的影响可能随年龄而变化。
内侧和外侧嗅小球之间存在功能差异。体内多电极实验揭示了内侧和外侧嗅球中气味诱发反应潜伏期的不同，钙成像实验报告称，与外侧嗅小球相比，内侧嗅小球的突触后细胞有更大的呼吸锁钙波动。之前，我们观察到饮食诱导的肥胖对内侧与外侧嗅小球的功能激活有不同影响，因此，我们预计在受体小鼠进行粪便微生物群移植后，外侧嗅小球可能比内侧嗅小球有更大的体积变化。但我们发现情况并非如此。内侧与外侧嗅小球对粪便微生物群移植的反应没有差异。虽然我们的假设被拒绝，并且我们没有看到嗅小球体积减少，但雄性受体小鼠有外侧嗅小球较小的趋势，雌性受体小鼠则没有。
