《Journal of Neuroendocrinology》：Profile of gonadotropin secretion in male and female rats determined in the tail-tip blood by ultrasensitive ELISA
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本文通过超灵敏ELISA（酶联免疫吸附测定）技术，创新性地对大鼠尾尖微量血样进行纵向采样，系统描绘了雄性和雌性大鼠在性腺完整、去势（orchiectomy/ovariectomy）及性激素（testosterone/estradiol）替代等不同状态下的促黄体生成素（LH）和卵泡刺激素（FSH）分泌动态。研究不仅验证了该微创方法的可靠性，还详细表征了大鼠动情周期中促性腺激素的波动规律，并揭示了睾酮和雌二醇对LH和FSH分泌存在差异化的负反馈调控，以及雌二醇在去卵巢大鼠中诱导LH和FSH下午峰（正反馈）的独特模式。这项工作为生殖内分泌学研究提供了重要的新方法学依据和生理学见解。
采用超灵敏酶联免疫吸附测定法（ELISA）对大鼠尾尖血中促性腺激素分泌谱的研究
摘要
本研究旨在通过一种准确且侵入性更小的方法来测定激素水平。研究者采用超灵敏酶联免疫吸附测定法（ELISA），纵向测定了雄性和雌性大鼠尾尖血中的促黄体生成素（LH）和卵泡刺激素（FSH）分泌情况。在雄性大鼠中，与性腺完整状态相比，ELISA检测到去势后LH和FSH分泌显著增加。随后对去势大鼠进行睾酮治疗，使LH浓度恢复至基础水平，而FSH分泌仅部分恢复至性腺完整水平。在大鼠动情周期中，LH和FSH分泌在发情间期围绕基础水平波动，两种激素的排卵前峰在发情前期的傍晚发生。在发情期，LH分泌持续处于低位，而FSH浓度则从早晨的较高水平逐渐下降至下午的较低水平。卵巢切除后，LH和FSH的分泌均上升至超过动情周期的基础水平。在去卵巢状态下进行雌二醇治疗，可在早晨将LH和FSH分泌降低至接近性腺完整水平，且对FSH的作用更强。在下午，雌二醇处理则引发了类似发情前期的LH急剧峰，同时伴有FSH水平较缓慢的渐进性升高。本研究通过超灵敏ELISA对尾尖血进行纵向激素测量，表征了两种性别大鼠在不同激素条件下的LH和FSH分泌特征。这些发现为与大鼠生殖内分泌学知识相关的促性腺激素分泌研究提供了新的方法学和概念性信息。
1 引言
促性腺激素的协调释放对于适当控制下丘脑-垂体-性腺（HPG）轴以及雄性和雌性的生育能力至关重要，它驱动配子发生和性腺激素的分泌。促黄体生成素（LH）和卵泡刺激素（FSH）由腺垂体分泌，这是对下丘脑促性腺激素释放激素（GnRH）的刺激和性腺类固醇反馈作用的综合反应。雌性中的雌二醇和雄性中的睾酮对HPG轴发挥负反馈作用，降低LH和FSH的分泌。此外，在自发排卵的雌性不同物种（如啮齿动物和灵长类动物）中，循环雌二醇水平的持续上升会引发正反馈效应，激活GnRH神经元，从而触发排卵前LH峰和排卵。在啮齿动物中，这种机制是雌性独有的，而雄性即使在去势后接受高剂量雌二醇治疗也不会出现LH峰。
促性腺激素分泌的测量在评估生殖功能方面具有临床意义。例如，FSH和LH水平通常在诊断性早熟、性发育障碍、低促性腺激素性性腺功能减退症、两性不孕症和更年期时进行常规评估。相应地，LH和FSH测量长期以来通过放射免疫分析法（RIA）在多个物种中进行。在雄性大鼠中，RIA已被用于准确测定促性腺激素分泌的生理变化，包括去势和睾酮替代对LH和FSH水平的影响。雌性啮齿动物整个动情周期的LH和FSH分泌谱也已通过RIA表征，并且发情前期的排卵前LH峰首次通过此方法得到证实。RIA也能有效检测去卵巢后LH和FSH水平的升高，以及雌二醇处理的去卵巢（OVX）大鼠中两种激素的降低。然而，尽管RIA可靠，但它依赖于放射性同位素，并且通常需要相当体积的血浆或血清进行分析。这些特点限制了其作为广泛激素测量方法的潜力，并且很难与需要随时间重复进行激素测量的研究兼容。因此，人们非常有兴趣开发新的非侵入性方法，能够以可靠、准确和灵敏的方式量化微量血液中的激素水平。
值得注意的是，超灵敏酶联免疫吸附测定法（ELISA）已被开发用于测量小鼠尾尖收集的全血中的生长激素、LH、催乳素和FSH。超灵敏LH和催乳素ELISA后来被调整用于大鼠尾尖血的激素测量。重要的是，这种方法仅需极少的血液体积进行检测，允许随时间进行连续和重复的血液采样，而不会产生因静脉插管手术导致的显著失血或应激的不良影响。尽管超灵敏FSH ELISA已开发用于小鼠，但类似的测定在大鼠中尚未经过测试。更重要的是，通过ELISA在大鼠尾尖血中测量的促性腺激素分泌的生理谱有待确定。
在本研究中，我们测试了一种内部制备的大鼠超灵敏FSH ELISA，并使用这种ELISA方法纵向表征了不同激素条件下雄性和雌性大鼠尾尖血中的LH和FSH分泌特征。本文报告的发现证明了这些测定在测量大鼠促性腺激素分泌方面的有效性，并进一步表征了动情周期中LH和FSH水平的变化、性腺类固醇在雄性和雌性中的负反馈调节，以及雌二醇对去卵巢大鼠LH和FSH分泌的正反馈效应。
2 材料与方法
2.1 动物
雄性和雌性Wistar大鼠，体重250至300克，按性别分开，每笼4只群养，饲养在受控光照（光照时间7:00至19:00）和温度（22 ± 2°C）条件下，自由摄食标准实验室饲料和水。每日采集阴道涂片，显示出至少三个连续规则动情周期的大鼠被纳入实验。所有程序均得到米纳斯吉拉斯联邦大学实验动物使用伦理委员会的批准。
2.2 实验设计
2.2.1 实验1：大鼠LH和FSH超灵敏ELISA的验证
LH和FSH超灵敏ELISA已开发用于小鼠，我们之前已使用超灵敏ELISA测量大鼠血液中的LH和PRL。由于FSH ELISA尚未在大鼠中进行验证，这里我们测试了一种修改后的FSH ELISA方案以用于该物种。该实验旨在验证LH和FSH ELISA在大鼠中准确检测激素的有效性。最初，我们测试了大鼠血浆是否会干扰测定的免疫反应性。随后，我们确定了ELISA在检测性腺完整和去卵巢（OVX）大鼠LH和FSH浓度变化方面的功效。对3月龄的动情周期大鼠进行卵巢切除或假手术，并在1个月（Sham-1 M；n = 7；OVX-1 M；n = 8）、2个月（Sham-2 M；n = 7；OVX-2 M；n = 8）或6个月（Sham-6 M；n = 8；OVX-6 M；n = 8）后处死。断头后收集躯干血，通过超灵敏ELISA测量血浆LH和FSH水平。
2.2.2 实验2：通过超灵敏ELISA测定去势和睾酮替代对大鼠LH和FSH分泌的影响
去势会由于去除睾酮和抑制素对下丘脑和垂体的负反馈作用而增加LH和FSH的分泌。我们的目的是通过超灵敏ELISA测定去势和睾酮替代后雄性大鼠LH和FSH分泌的变化。我们采用纵向方法，在同一只大鼠身上依次评估三种不同的激素条件，从而使其作为自身的对照。在每个实验条件下，于10:00至12:00之间每小时采集三次20 μL的尾尖血样。三种血液样本的测量值按每只大鼠在每个实验条件下取平均值。最初，对性腺完整的大鼠进行尾尖血采集（完整状态）。5天内，对大鼠进行去势（ORX），恢复10天后，皮下注射玉米油连续7天，并在次日进行血样采集（ORX状态）。15天后，对ORX大鼠进行睾酮治疗连续7天，并在次日进行尾尖血采样方案（ORX + T状态）。通过超灵敏ELISA在全血中测量LH和FSH水平。
2.2.3 实验3：通过超灵敏ELISA测定大鼠动情周期中的LH和FSH分泌
大鼠动情周期中LH和FSH的分泌模式主要使用终端采血和血浆RIA建立。本实验旨在通过ELISA测量连续全血样本，进一步表征大鼠动情周期中LH和FSH分泌的时间谱。动情周期天数根据阴道细胞学特征性细胞类型定义。在发情间期、发情前期或发情期，从不同组的大鼠身上每小时采集10次20 μL的尾尖血样，时间从10:00到19:00。通过ELISA在全血中测量LH和FSH。
2.2.4 实验4：通过超灵敏ELISA测定去卵巢和雌二醇替代对大鼠LH和FSH分泌的影响
雌性大鼠去卵巢后LH和FSH水平升高，在去卵巢大鼠中进行雌二醇治疗会在早晨和下午分别对LH分泌产生负反馈和正反馈效应。本实验旨在通过超灵敏ELISA表征去卵巢和随后雌二醇替代后雌性大鼠LH和FSH的分泌模式。实验采用纵向设计，在同一只大鼠身上评估三种不同的激素条件。为了研究雌二醇的负反馈效应，在08:00至10:00之间每小时采集三次20 μL血样。三种血液样本的测量值按每只大鼠在每个实验条件下取平均值。相应地，最初从处于发情间期的性腺完整大鼠收集血样（完整状态）。5天内，对大鼠进行卵巢切除，恢复10天后，皮下注射玉米油连续3天，并在次日进行血样采集（OVX状态）。15天后，然后对OVX大鼠进行雌二醇治疗连续3天，并在次日从8:00到10:00每小时采集血样（OVX + E2状态，负反馈）。为了确定雌二醇的正反馈，使用相同的雌二醇治疗方案，并从一组OVX + E2大鼠中额外采集9次血样，从11:00到19:00每小时一次（OVX + E2状态，正反馈；n = 5）。通过超灵敏ELISA在全血中测量LH和FSH。
2.3 手术程序和药物治疗
对于卵巢切除或去势，大鼠用腹腔注射氯胺酮和赛拉嗪麻醉。手术后，大鼠用五联抗生素和镇痛药治疗。睾酮用含10%乙醇的玉米油稀释，在9:00皮下注射。所使用的睾酮治疗方案可在ORX大鼠中产生生理性睾酮水平，并恢复LH水平和前列腺重量。雌二醇用含10%乙醇的玉米油稀释，每天在9:00皮下注射，连续3天。该雌二醇治疗方案在去卵巢大鼠中产生生理性循环雌二醇水平，恢复子宫重量，抑制早晨LH分泌，并在下午产生类似发情前期的LH峰。
2.4 尾尖血采样
大鼠尾尖采血按先前描述的方法进行。在实验前至少每天处理大鼠30天，使其适应尾尖采血程序。在采血前立即剪掉尾部远端1-2毫米，并在每个实验预定的时间点每小时用微量移液器采集20 μL尾尖血样。全血样本立即以1:20的稀释度悬浮在含有0.05% Tween-20的磷酸盐缓冲盐水（PBS-T）中，置于冰上，并储存于-20°C直至LH和FSH测量。
2.5 ELISA
大鼠血浆（实验1）和全血（实验2、3和4）中的LH和FSH水平通过超灵敏夹心ELISA测定。LH ELISA改编自先前描述的方法。简言之，用50 μL单克隆抗牛LH-β抗体在PBS中1:2500稀释包被96孔高结合板，4°C过夜。弃去包被抗体，孔中加入200 μL封闭缓冲液，室温孵育2小时。使用大鼠LH参考品RP-3在含有0.2%牛血清白蛋白的PBS-T中进行2倍系列稀释制备标准曲线。孔中加入50 μL 1:20稀释的样品，室温过夜孵育。洗板后，孔中加入50 μL兔抗大鼠LH抗体，在含有0.2% BSA的PBS-T中1:100,000稀释，室温孵育6小时。洗涤后，孔中加入50 μL辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG，室温孵育90分钟。最后洗涤后，孔中加入100 μL 2 mg/mL邻苯二胺二盐酸盐在柠檬酸-磷酸盐缓冲液（pH 5.0）中含有0.02%过氧化氢，室温孵育45分钟。用50 μL 3 M盐酸终止反应。然后在490 nm波长下测定吸光度，并使用650 nm波长进行背景校正。检测下限为0.070 ng/mL，批内和批间变异系数分别为3.3%和10.4%。大鼠FSH ELISA使用与上述LH ELISA相同的方案开发，但替换了特异性抗体和参考品。相应地，用50 μL豚鼠抗大鼠FSH抗体在PBS中1:2000稀释包被96孔高结合板，4°C过夜。使用大鼠FSH参考品RP-2在含有0.2% BSA的PBS-T中进行2倍系列稀释制备标准曲线。孔中加入50 μL 1:20稀释的样品，室温过夜孵育。洗板后，孔中加入50 μL兔抗大鼠FSH抗体，在含有0.2% BSA的PBS-T中1:10,000稀释，室温孵育6小时。然后孔中加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG和邻苯二胺二盐酸盐。在490 nm测定吸光度，并使用650 nm读数进行背景校正。检测下限为0.154 ng/mL，批内和批间变异系数分别为5.4%和9.9%。同一实验的所有样本均在单次测定中检测。LH和FSH水平通过将样品的光密度插入各自标准曲线的非线性回归中获得。通过生成在不存在或存在20%大鼠血浆情况下的LH和FSH标准曲线稀释液进行平行性测试。
2.6 统计分析
数据以平均值 ± 标准误表示，并使用GraphPad Prism进行分析。在进行方差分析比较之前，检查数据的正态性和方差齐性。采用双向方差分析后进行Bonferroni事后检验（实验1）或重复测量单因素方差分析后进行Bonferroni事后检验（实验2、3和4）。雄性大鼠的LH和FSH数据、发情前期的LH数据以及雌性大鼠在8-10小时的FSH数据在单因素方差分析前进行了对数转换以满足方差齐性标准。p < .05被认为具有统计学显著性。
3 结果
3.1 大鼠LH和FSH超灵敏ELISA的验证
图1显示了大鼠LH和FSH超灵敏ELISA的标准曲线，分别使用相应的激素参考品在有或无添加大鼠血浆的情况下生成，以测试其对测定的干扰。标准曲线显示，LH和FSH的检测受大鼠血浆的影响极小。在两种测定中，在最高参考品浓度（10 ng/mL）水平下发现了更明显的大鼠血浆负面影响。然而，几乎没有血浆或血样在此曲线区域被定量，表明LH和FSH的检测未受到与大鼠蛋白质非特异性相互作用的显著影响。此外，LH和FSH ELISA能有效检测短期和长期去卵巢雌性大鼠血浆中促性腺激素水平的升高。如双向方差分析所确定，卵巢切除对血浆LH水平有主效应，但对时间或交互作用无影响。相应地，与假手术组相比，去卵巢后所有评估时间点的OVX大鼠LH水平均同样升高。同样，卵巢切除对血浆FSH有主效应，对时间或交互作用无影响。如Bonferroni事后检验所确定，卵巢切除后1、2和6个月的OVX大鼠FSH分泌高于假手术组大鼠，并且检测到OVX-6 M大鼠的FSH分泌比OVX-1 M大鼠进一步升高。总之，这些结果表明LH和FSH超灵敏ELISA能可靠地检测大鼠中预期的促性腺激素分泌变化。
3.2 通过超灵敏ELISA测定去势和睾酮替代对大鼠LH和FSH分泌的影响
然后我们确定了去势和睾酮治疗对LH和FSH分泌的影响，这些激素通过超灵敏ELISA在全血中纵向测量。正如预期，血液LH水平因去势和睾酮替代而改变。与完整状态相比，去势增加了LH水平。随后的睾酮替代降低了ORX + T状态下的LH分泌，使其恢复至完整状态的基础水平。与LH反应相似，FSH分泌也因去势和睾酮治疗而改变。与完整状态相比，ORX状态下的血液FSH水平显著升高。睾酮治疗后，ORX + T状态下的FSH水平与ORX相比显著降低。然而，ORX + T状态下的FSH水平仍显著高于完整状态的基础水平，表明与LH不同，睾酮治疗未能将雄性大鼠的FSH水平完全恢复至性腺完整水平。ORX + T状态下的前列腺重量与在性腺完整大鼠中发现的一致，证实了该实验中睾酮替代在生理范围内的有效性。
3.3 通过超灵敏ELISA测定大鼠动情周期中的LH和FSH分泌
在本实验中，我们测定了整个大鼠动情周期全血中LH和FSH水平的波动。在发情间期，LH水平较低，有离散的个体波动，但在白天无显著变化。在发情前期，LH水平在早晨保持基线值，个体波动较小。下午则以排卵前LH峰为标志，LH水平平均在16:00左右开始上升，在18:00达到峰值，并在19:00开始下降。在发情期，血液LH水平大幅降低，尽管存在个体波动，但在全天保持不变的基线水平。至于FSH分泌，在发情间期，该激素的血液水平变异性低，并且全天保持持续低位。在发情前期，FSH水平变异性增加，但在17:00之前无显著变化，此时FSH水平平均上升，并在18:00达到排卵前峰的峰值。在发情前期一只大鼠的三个样本（10:00至12:00）中FSH水平未检出。在发情期，FSH分泌从10:00缓慢下降至17:00的最低浓度。
3.4 通过超灵敏ELISA测定去卵巢和雌二醇替代对大鼠LH和FSH分泌的影响
接下来，我们评估了卵巢切除和雌二醇替代的双重效应对大鼠促性腺激素分泌的影响，这些激素通过超灵敏ELISA在全血中纵向测量。已知雌二醇对去卵巢大鼠的促性腺激素分泌发挥双重作用。这包括在早晨抑制LH和FSH分泌（负反馈效应的结果），以及在下午通过正反馈刺激LH峰。在8:00至10:00之间，正如预期，由于去除卵巢的负反馈信号，OVX状态下的血液LH水平高于完整状态，而雌二醇治疗在OVX + E2状态下将LH水平完全恢复至性腺完整值。同样，在早晨，OVX状态下的FSH分泌高于完整和OVX + E2状态。反过来，雌二醇治疗不仅恢复了FSH分泌，还进一步将其降低至低于完整状态的水平。然后我们评估了OVX + E2状态下11:00至19:00的促性腺激素分泌谱，以评估雌二醇的正反馈效应。相应地，血液LH浓度在15:00之前较低，此时雌二醇诱导的LH峰开始，LH水平在16:00左右上升，峰值在17:00和18:00之间，并在19:00恢复至基线水平。雌二醇也引发了下午FSH分泌的增加。然而，与LH峰不同，雌二醇诱导的FSH升高特点是该激素分泌的持续、渐进性增加，其在17:00至19:00达到的血液水平高于早晨时段。确认雌二醇治疗的有效性，OVX + E2状态下的子宫重量与先前在相同雌二醇治疗方案下发情前期和OVX + E2大鼠中发现的一致。
4 讨论
在本研究中，我们使用高灵敏度ELISA测量了不同激素条件下大鼠微量全血样本中的LH和FSH水平，以表征通过这种新方法测定的该物种促性腺激素分泌特征。我们最初验证了ELISA在添加大鼠血浆情况下检测大鼠LH和FSH水平的准确性，以及其在检测去卵巢后预期促性腺激素升高方面的功效。随后，我们纵向表征了在性腺类固醇不同调节下雄性和雌性大鼠尾尖血中的LH和FSH分泌特征。预期的促性腺激素变化以及关于雌二醇诱导FSH峰的新信息，是在从无静脉插管、无应激大鼠连续获得的微量血样中测量的报告，为大鼠促性腺激素分泌提供了相关的方法学和生理学信息，这些信息与生殖内分泌学知识相关。
LH和FSH ELISA能够灵敏地检测假手术和OVX大鼠在手术后不同时间点这些促性腺激素分泌的改变。与假手术组相比，卵巢切除后所有调查时间点的OVX大鼠血浆LH和FSH水平均显著升高，正如去除卵巢类固醇对促性腺激素分泌的负反馈所预期。此外，我们观察到卵巢切除后的较长时间不影响LH分泌，从手术后1到6个月（大鼠年龄4到9个月）LH同样升高。另一方面，OVX大鼠的F
