《Journal of Neuroendocrinology》：Ovarian influence on circadian and infradian modulation of nicotine-seeking in female mice
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本研究深入探讨了卵巢激素在雌性动物尼古丁寻求行为及其对卵巢健康影响中的关键作用。通过建立雌性C57BL/6小鼠的尼古丁雾化强迫给药昼夜节律模型，研究发现卵巢完整（INT）的小鼠可形成明确的尼古丁预期性活动，而卵巢切除（OVX）则完全消除了此行为，表明卵巢激素是调节此行为的主要因素。同时，尼古丁暴露会扰乱发情周期，并导致卵巢卵泡结构损伤，卵泡总数和卵巢直径显著减小。本研究揭示了性激素状态对成瘾行为的调控，并阐明了尼古丁使用与下丘脑-垂体-性腺（HPG）轴之间的双向关系，为女性生殖健康风险提供了新见解。
卵巢对雌性小鼠尼古丁寻求行为的昼夜与超日节律调控的影响
引言
精神活性物质（PAS）滥用是一种复杂的精神障碍，其特点是尽管存在严重不良后果，仍强迫性寻求和使用物质。烟草是男女中最广泛消费的PAS之一。尽管全球男性吸烟者总数更多，但最新研究强调了性别在暴食行为和药物使用进展方面的显著差异。女性表现出一种独特的脆弱性，即“加速效应”，她们倾向于更早开始用药，更快速过渡到物质使用障碍，报告比男性更难维持戒断，但比男性更早寻求治疗。这种趋势与月经周期中卵巢激素的波动有关，因为女性在卵泡期会经历更强的焦虑和压力，这可能会增加复吸风险。
临床研究表明，卵巢激素波动，特别是雌激素和孕激素，可能在PAS滥用相关的性别差异中起作用。临床前研究中也观察到类似发现，雌性在成瘾周期的早期阶段通常比雄性表现出更大的脆弱性。此外，每天在固定时间接受药物的动物，在接触5-8天后，可以开始预测药物何时可用。这种行为被称为预期性活动，是一种昼夜节律反应，其特征是在给药前1-2小时运动活动增加。然而，当药物获取发生在昼夜节律周期之外时，不会观察到这种预期，这表明昼夜节律系统可能在建立规律PAS消费模式中发挥作用。
尽管在PAS消费的行为反应中存在有记录的性别二态模式，但雌二醇在成瘾周期尼古丁寻求阶段的作用，在昼夜节律背景下仍未得到充分探索。本研究旨在探究卵巢激素对雌性C57BL/6小鼠尼古丁寻求行为的影响，并检验尼古丁暴露对卵巢结构的影响。
材料与方法
本研究使用了32只5周龄的雌性C57BL/6小鼠。动物随机分配到四个组：卵巢完整接受水雾化（INT-W）、卵巢切除接受水雾化（OVX-W）、卵巢完整接受尼古丁雾化（INT-N）和卵巢切除接受尼古丁雾化（OVX-N）。尼古丁酒石酸盐（3 mg/mL）通过雾化系统在固定时间（ZT4）每天给予20分钟，持续14天。运动活动通过跑轮连续监测。通过阴道细胞学评估发情周期。实验结束后，收集卵巢进行组织学和超微结构分析。使用苏木精-伊红（HE）染色和透射电子显微镜（TEM）评估卵巢形态和卵泡发育。使用统计软件对数据进行方差分析和非参数检验。
结果
尼古丁雾化对运动活动的影响
为了评估雾化尼古丁的行为效力并确定实验剂量，小鼠通过雾化系统暴露于递增浓度的尼古丁（0-3 mg/mL）。雾化尼古丁以剂量依赖的方式增加了运动活动。暴露于低浓度尼古丁（1和2 mg/mL）在雾化后2小时内未显著改变跑轮活动，而暴露于3 mg/mL尼古丁则导致运动活动显著增加，与皮下注射尼古丁（3.5 mg/kg）观察到的效果相当。
对尼古丁的预期反应
代表性活动图显示，在INT-N动物中，在预定尼古丁暴露前有明显的预期性运动活动，而这种模式在OVX-N小鼠中不明显。这些定性模式与预期性活动的定性分析一致，支持卵巢激素在尼古丁诱导预期行为中的调节作用。在雾化阶段，活动谱证实了活动图中观察到的模式：INT-N组形成了预期性活动，而OVX-N组仅在雾化后活动增加，雾化前的活动与OVX-W组相当。尽管存在这些时间差异，各组（INT-W vs. INT-N vs. OVX-W vs. OVX-N）之间每日（24小时）总跑轮活动没有显著差异。
尼古丁诱导的行为变化和激素剥夺对尼古丁寻求行为的影响
在4小时窗口（雾化前2小时和雾化后2小时）内计算跑轮转数的百分比，以评估预期行为和尼古丁的急性反应。只有接受尼古丁雾化的卵巢完整动物（INT-N）在雾化前2小时表现出运动活动增加。数据分析显示，在PRE时间点，INT-N组和INT-W组之间，以及INT-N组和OVX-N组之间存在显著差异。组与时间之间存在显著的交互作用，表明各组的PRE和POST之间变化不同。
尼古丁暴露期间的超日和昼夜节律改变
我们分析了14天雾化期间完整雌性小鼠的每日预期性活动模式，以评估发情周期是否影响尼古丁寻求行为。预期性运动活动显示出4天的周期性模式。当检查INT-N组的活动图与发情周期阶段的关系时，发现预期性活动的增加主要发生在从发情前期到发情期的过渡阶段，而活动幅度的降低更常与非接受期（发情间期/发情后期）相关。鉴于发情前期的特点是雌二醇短暂激增，随后在发情期迅速下降，这些观察表明，尼古丁诱导的预期性活动不是简单地由高雌激素水平调节，而是由动态的卵巢激素波动调节，可能反映了雌激素依赖的神经启动和随后激素撤退期间的延迟行为表达。相比之下，OVX-N小鼠的活动在整个雾化阶段保持稳定，各天之间没有显著差异。
尼古丁诱导的发情周期持续时间变异
评估了雾化期间完整发情周期的数量，与INT-W组相比，INT-N组的周期数显著减少。在分析每周周期持续时间时，第一周没有发现差异，然而，在第二周，尼古丁组的周期持续时间显著更长。图示表明，对照动物具有典型的节律性，发情期每4-5天发生一次，而INT-N组表现出不同步和延长的发情间期，持续3-4天。对每个阶段的进一步分析显示，暴露于尼古丁的小鼠发情间期持续时间显著增加。
雾化尼古丁对卵巢结构的影响
卵巢形态学分析显示，暴露于雾化尼古丁的动物卵巢比暴露于雾化水的对照组显著更小。这表明尼古丁对卵泡发育和卵巢大小有不利影响。与INT-W组相比，INT-N组初级卵泡、次级卵泡、有腔卵泡和黄体的数量显著减少。因此，INT-N组的总卵泡数低于INT-W组。
使用HE染色的组织学分析揭示了尼古丁处理动物卵巢的明显结构改变。水处理动物保留了标准的卵泡结构，而尼古丁组则表现出皮质萎缩和大量凋亡细胞，特别是在有腔卵泡和排卵前卵泡中。此外，理论卵巢直径评估发现，尼古丁组的卵巢显著小于对照组。
描述性卵巢超微结构分析
代表性组织学图像进一步证实了结构损伤。对照卵泡显示出典型的组织，而暴露于尼古丁的小鼠的卵泡显示出细胞凋亡增加和颗粒细胞连接破坏。暴露于雾化水的雌性小鼠显示出正常的卵巢超微结构，其特征是保存良好的细胞组织和完整的细胞器。相比之下，暴露于雾化尼古丁的小鼠在卵巢结构上表现出异常，表明存在细胞应激、损伤或功能障碍。最显著的发现包括卵母细胞和卵泡退化。卵母细胞核常出现核固缩、染色质边集或核碎裂，提示细胞凋亡。常见观察到胞质空泡化，以及线粒体肿胀或形态不规则、嵴断裂、密度降低，表明代谢活动受损。内质网扩张或断裂，高尔基复合体常解体或减少。延伸进入透明带的微绒毛减少或缺失，削弱了卵母细胞和颗粒细胞之间的通讯。透明带常显得不规则、增厚或部分崩解。此外，颗粒细胞表现出退化迹象，包括细胞皱缩、细胞膜不规则、细胞间隙增大、胞质空泡化和核浓缩或碎裂。凋亡小体广泛分布于整个组织中。这些观察表明尼古丁暴露加速了卵泡闭锁，并暗示卵巢功能受损。
讨论
行为效应的昼夜节律调节
雾化提供了一种无创方法，模拟了年轻人中现代尼古丁电子烟的使用，同时避免了与侵入性给药途径相关的应激相关昼夜节律紊乱。使用这种方法，完整的C57BL/6雌性在尼古丁给药前1-2小时表现出预期性运动活动，而OVX-N小鼠则没有，这突显了雌二醇在介导行为敏化中的作用。预期性活动在INT-N中显著高于OVX-N，而雾化后的反应相似，表明卵巢激素，很可能是雌二醇，影响预期性活动而非暴露后的活动，因为卵巢切除术消除了这种效应。在OVX-N组中没有观察到预期性活动，表明卵巢激素，特别是雌二醇，对于这种反应是必需的。此外，诱导的预期性活动的幅度与发情周期的节律相关，表明内源性激素振荡，特别是雌二醇，调节尼古丁寻求动机。
发情周期期间运动活动的变化：一种超日节律模式
14天完整雌性的运动活动显示出明显的超日模式（约4天周期性），对应于发情周期。在雌二醇水平高的阶段，如发情前期和发情期，活动明显更高，而在发情间期和发情后期则较低，这表明卵巢激素水平与尼古丁反应之间存在相互作用。这种变化可能是由雌激素作用于存在于昼夜节律系统组件中的受体介导的，从而影响药物寻求行为的表达。
尼古丁暴露扰乱了完整雌性的发情周期，减少了完整周期的数量，延长了第二周的周期，并延长了发情间期的持续时间。这些改变表明尼古丁可以通过雌二醇依赖机制干扰超日生殖节律。OVX-N小鼠缺乏卵巢激素，没有显示出这些紊乱，强化了激素调节对尼古丁诱导的生殖周期效应的必要性。
尼古丁对卵巢结构的影响
除了行为改变，我们评估了尼古丁对卵巢结构和功能的影响。在暴露于尼古丁雾化的雌性（INT-N）中观察到形态学变化，与皮质萎缩、颗粒细胞完整性丧失和卵泡退化迹象相关。这些改变与报告烟草烟雾诱导卵巢损伤的研究一致。此外，还记录到卵巢大小和卵泡数量显著减少。即使在相对较短的暴露期后，卵泡发生也受到损害。这些发现突出了卵巢组织对吸入尼古丁的高度敏感性，并表明尼古丁使用即使间歇使用也可能对生育能力产生负面影响，因为尼古丁已被证明可以减少内源性雌二醇合成。卵巢结构损伤，加上发情周期紊乱以及与动机和药物寻求相关的运动活动变化，进一步证明了育龄妇女使用尼古丁的风险。
卵泡发育
我们的发现与先前证据一致，表明暴露于香烟烟雾会减少卵巢卵泡数量。值得注意的是，我们的研究分离了尼古丁的特异性效应，独立于烟草烟雾的其他成分。我们观察到尼古丁暴露后卵泡数量类似减少，表明尼古丁本身可能直接损害卵泡发育。总体而言，这些观察结果突显了尼古丁的生殖毒性，并强调了评估其单独影响的重要性，独立于烟草烟雾的其他成分。
雌二醇作为尼古丁神经效应的调节剂
在卵巢切除的雌性小鼠中，活动诱导的脑源性雌二醇合成对于海马长时程增强是必不可少的，这表明当外周激素输入缺失时，局部产生的雌激素具有补偿作用。大脑似乎根据雌激素丧失是逐渐发生（如更年期）还是突然发生（如卵巢切除）以不同方式调节局部雌激素机制。在此背景下，我们的结果显示，OVX-N组没有表现出与INT-N组相同水平的尼古丁寻求行为，尽管接受了相同的给药方案。卵巢切除雌性中尼古丁寻求行为的缺失可归因于卵巢切除后激素调节的变化，特别是循环雌激素的显著下降。
雌二醇波动对尼古丁诱导的昼夜节律的分子影响
我们的发现表明，雌二醇水平的波动，特别是由尼古丁暴露引起的波动，可能对昼夜节律的分子调节产生重要影响。雌二醇通过结合雌激素受体直接作用于下丘脑视交叉上核（SCN），调节转录-翻译反馈环路。这种相互作用调节核心时钟基因如Per、Cry和Bmal1的表达，从而增强昼夜周期的稳定性和幅度。在小鼠模型中，尼古丁和相关成分显著影响外周组织（如肺）中Clock、Bmal1、Per2、Cry2和Rev-erbα/β的表达，导致相位计时改变和振荡幅度降低。总之，这些发现意味着尼古丁不仅通过激素抑制，还通过直接分子破坏时钟机制来干扰昼夜节律调节，可能加剧系统性节律的失稳。
性别、月经周期和女性尼古丁的激素调节
几项研究表明，性别和月经周期阶段显著影响对尼古丁的主观、生理和认知反应。对戒断吸烟者的对照静脉尼古丁给药显示，与男性相比，女性表现出较低的主观反应，但表现出更大的生理唤醒。此外，处于月经黄体期的女性，以孕激素相对于雌二醇的相对优势为特征，与卵泡期女性相比，表现出尼古丁主观效应更显著的降低，同时认知能力增强。这些发现表明，周期性激素波动调节对尼古丁强化的敏感性，并可能促成观察到的尼古丁使用和复吸脆弱性的性别差异。黄体期可能代表了一个生理上不易受尼古丁强化的窗口，可能是由于孕激素和雌二醇介导的对多巴胺能回路和烟碱受体效应的功能性拮抗。
结论
总体而言，这项工作为卵巢激素在调节尼古丁寻求行为以及尼古丁对雌性小鼠卵巢健康的不利影响中的重要作用提供了令人信服的证据。它强调了在成瘾研究和治疗策略中考虑性别和激素状态的必要性。
