轴突起始段（AIS）线粒体钙动态缓冲对动作电位产生非必需性的功能解析

《The Journal of Physiology》：Robust activity-dependent mitochondrial calcium dynamics at the AIS is dispensable for action potential generation

本研究综合运用三维电子显微镜重建、双光子钙成像和电生理记录技术，在脑皮层第五层（L5）锥体神经元中系统地研究了轴突起始段（AIS）线粒体的分布、钙离子（Ca2+）缓冲功能及其对神经元电活动的影响。结果表明，线粒体高密度、稳定地聚集在AIS的近端，并在动作电位（AP）发放时强力摄取胞质钙。然而，通过线粒体钙单向转运体（MCU）抑制剂Ru360阻断钙摄取后，虽然延长了慢后超极化（AHP）的持续时间，但动作电位的产生、波形、输入-输出功能及高频簇状发放均未受影响。这些发现表明，AIS线粒体在生理条件下具有强大的钙缓冲能力，但其主要功能可能在于调节非电生理过程，如维持细胞稳态或结构可塑性，而并非动作电位编码所必需。

　　

线粒体在轴突起始段密集分布并稳定存在

线粒体是真核细胞中负责产生三磷酸腺苷（ATP）的多功能细胞器，在神经元中尤其重要，参与调节能量供应、脂质代谢和钙离子（Ca²⁺）信号传导。神经元形态的高度极化和区室化也反映在线粒体群的多样性上。轴突起始段（AIS）是动作电位（AP）起始的关键亚细胞区室，高密度地聚集了电压门控离子通道。先前研究表明，AIS的活性依赖性Ca²⁺内流是神经元中幅度最大的之一，并且Ca²⁺通过激活钾通道（K_Ca）和调节电压门控钠、钾通道，在AP波形和兴奋性中发挥重要作用。然而，AIS线粒体的功能尚不清楚。

为了在超微结构水平研究AIS线粒体的分布，研究人员利用公开的成年小鼠初级视皮层三维电子显微镜（3D EM）数据集，对厚簇状第五层（L5）锥体神经元的AIS和第一个有髓鞘节间段的线粒体进行了分割和量化。结果显示，线粒体主要占据AIS的近端区域，在远端10微米处出现的概率显著降低。在AIS整体上，线粒体密度显著高于第一个节间段。进一步将AIS长度平均分为近端和远端两半进行比较发现，线粒体在近端AIS的密度是远端的两倍以上，并且远端AIS的线粒体体积显著小于节间段的线粒体。这些结果表明线粒体密集分布于AIS近端。

为了在分子标记的AIS中进一步验证线粒体分布，研究使用了Cre依赖的病毒工具，在L5锥体神经元中选择性表达靶向线粒体的绿色荧光蛋白（mt-GFP），并结合βIV-血影蛋白免疫标记来识别AIS。对急性脑片中进行膜片钳记录并填充生物胞素的神经元进行重建，结果与3D EM数据一致，显示线粒体密度在AIS近端最高，并随着与胞体距离的增加而下降。与3D EM相比，免疫组化显示的线粒体密度较低，这可能是由于共聚焦显微镜的空间分辨率限制，无法检测到更小的线粒体。

接下来，研究通过活体双光子成像观察AIS线粒体的运动性。尽管部分线粒体是运动的，但大多数（约73.6%）在成像期间（8-10分钟）稳定地存在于AIS。运动线粒体主要呈顺向（从胞体向轴突末端）移动，且其尺寸显著小于稳定线粒体。线粒体大小与运动速度无相关性。综合EM、免疫组化和活体成像的结果表明，线粒体主要定位于AIS近端并保持稳定。

AIS线粒体强力缓冲动作电位依赖性钙离子

L5锥体神经元的AIS和郎飞结以活动依赖性的大幅Ca²⁺流为特征。研究接着探究了AIS线粒体的活动依赖性Ca²⁺缓冲是否与胞体、节间段和结区不同。通过在L5锥体神经元中选择性表达线粒体靶向的基因编码钙指示剂mt-GCaMP6f，并结合胞内填充红色钙指示剂染料Cal-590，研究人员得以在胞体、AIS、有髓鞘节间段和结区同时成像胞质钙（cyt-Ca²⁺）和线粒体钙（mt-Ca²⁺）的活动依赖性响应。

数据显示，在发放动作电位串期间，mt-Ca²⁺瞬变在时间上滞后于cyt-Ca²⁺，延迟约150毫秒达到峰值，但衰减时间常数相近。比较不同轴突亚区室的钙响应幅度发现，cyt-Ca²⁺和mt-Ca²⁺响应在AIS均为最强，而在有髓鞘节间段非常微弱甚至没有。在结区能检测到AP依赖的cyt-Ca²⁺增加，但mt-Ca²⁺瞬变与之配对不规则，提示Ca²⁺内流可能不足以激活线粒体钙单向转运体（MCU）。此外，研究发现较小的线粒体表现出较大的Ca²⁺瞬变幅度，但mt-Ca²⁺瞬变幅度与线粒体距离胞体的位置无相关性。综上所述，这些发现表明在L5锥体神经元轴突中，AIS线粒体强力缓冲了峰电位活动依赖性的胞质Ca²⁺。

抑制线粒体钙摄取延长高频动作电位诱发的慢后超极化

线粒体Ca²⁺缓冲此前已被证明可降低胞质Ca²⁺浓度并缩短慢后超极化（AHP）的持续时间。鉴于L5锥体神经元AIS的胞质Ca²⁺能达到高浓度，并同时影响单动作电位特性和慢AHP，研究人员假设AIS线粒体的Ca²⁺缓冲会影响膜兴奋性。

为了验证这一点，研究在进行全细胞膜片钳记录的同时，通过胞内液灌注选择性MCU抑制剂Ru360，该药物通过结合线粒体膜间隙的MCU来有效阻断线粒体Ca²⁺摄取。结果显示，灌注Ru360 45分钟后，mt-Ca²⁺响应平均降低了81%。接下来，研究使用多种刺激范式检测阻断mt-Ca²⁺对膜兴奋性的作用。通过注射时间精确的短时电流，诱发不同频率和数量的动作电位串，并量化慢AHP的峰值幅度、半峰宽和曲线下面积。

与先前工作一致，研究发现Ru360选择性地在高频刺激（50或100 Hz）下显著增加了AHP的持续时间，但未改变其峰值幅度或曲线下面积。在动作电位刺激终止2秒后测量AHP幅度，也未检测到处理效应。此外，膜电位恢复到基线的速率以及静息膜电位在Ru360处理后均未受影响。这些结果证实，线粒体Ca²⁺缓冲在高频放电时缩短了慢AHP的初始时程。

动作电位特性不依赖于线粒体钙缓冲

由于L5锥体神经元的慢AHP部分受线粒体Ca²⁺缓冲调节，研究人员推测这可能也影响其他钙敏感的电压门控通道，进而影响放电特性。例如，缓慢激活的Kv7通道在静息膜特性、动作电位阈值调节中起关键作用，并受胞质Ca²⁺门控。Ru360介导的mt-Ca²⁺缓冲缺失预计会增加胞质Ca²⁺，导致Kv7通道关闭，从而通过降低动作电位产生的电流阈值来增加神经元兴奋性。

为探索这种可能性，研究向细胞注入递增的电流阶跃，比较对照组和Ru360处理组细胞的动作电位产生。由于线粒体Ca²⁺缓冲发生相对较慢，在动作电位发放期间延迟约150毫秒并在约1秒时达到峰值，Ru360处理可能优先影响动作电位串末尾的动作电位。因此，研究分析了在700毫秒电流注射期间诱发的每个动作电位串的最后一个动作电位。然而，未发现Ru360对动作电位电压阈值、幅度或半峰宽有影响。同时，电流注入产生的动作电位数量、基电流和输入电阻在两组间也无差异。

L5锥体神经元以产生短时高频簇状放电为特征，这主要由钠通道快速开放介导，并受Kv7和BK通道调节，而这些通道都是钙门控的。研究人员假设线粒体Ca²⁺对膜兴奋性的调节可能发生在短峰电位间隔的时间尺度上，因此在量化平均频率时其贡献可能被掩盖。于是，研究进一步探究了线粒体Ca²⁺缓冲对簇状放电特性的作用。

首先，比较了在建立全细胞记录后立即（破膜时）和经过45分钟Ru360或对照液灌注后，在基电流水平产生的高频动作电位数量。在对照组和Ru360灌注的神经元中，都观察到高频动作电位数量减少，这可能是由于胞质被记录液稀释所致，但两组间的减少程度无差异。同样，保持簇状放电的神经元比例在两组间也相似。其次，在保持稳定簇状放电的神经元中，比较了簇内的动作电位特性。量化簇状放电频率显示，抑制mt-Ca²⁺缓冲无影响。虽然Ru360灌注增加了簇内第一个动作电位的幅度，但第二个动作电位的幅度未受影响。此外，所有动作电位的电压阈值、半峰宽和dV/dt值在组间均具有可比性。

最后，为研究mt-Ca²⁺缓冲是否影响动作电位的AIS成分，研究记录了由3毫秒短脉冲诱发的单个动作电位的上升支。Ru360灌注后，动作电位幅度、半峰宽、电流和电压阈值均保持不变。此外，相位图分析清晰显示了在胞体记录的动作电位波形中AIS和胞体成分在电压-时间上的分离。结果显示，Ru360并未改变AIS或胞体成分的上升速率峰值。与AIS兴奋性无影响一致，动作电位起始的快速性在Ru360灌注后也未改变。

综上所述，这些电生理实验表明，AIS处强大的线粒体Ca²⁺缓冲并不影响动作电位的产生。

AIS线粒体的解剖分布与非电生理角色

AIS远端线粒体数量相对于节间段较少，这与近期在哺乳动物运动神经元、人诱导多能干细胞和果蝇AIS中线粒体分布的研究结果一致。本研究进一步明确了线粒体沿AIS存在近端-远端梯度，远端AIS的线粒体显著更小。决定线粒体沿AIS亚区室分布的分子机制尚不完全清楚。钙依赖性锚定、与内质网（ER）或轴突膜的束缚，以及与电压门控离子通道分布共享定位机制等，都是可能的解释。

由于动作电位起始通常发生在AIS远端区域，本研究的解剖和功能数据表明，在基线条件下，线粒体钙处理对动作电位起始是非必需的。如果不影响兴奋性，AIS线粒体的作用可能是什么？一种有趣的可能性是，MCU介导的AIS钙输入可能在胞质钙长期升高的时期发挥作用，并作为细胞稳态和结构可塑性的指导信号，类似于在线粒体在树突棘和突触前终末的作用。与此观点一致，全局性MCU敲除保留了基线活动水平和线粒体超微结构，但使皮层神经元在呼吸能力无法抵消增加的糖酵解需求时变得脆弱。

在神经元活动强烈增加期间，AIS远端会通过电压门控钠通道和锚蛋白G蛋白在数十分钟内从远端AIS质膜内存作用而缩短。由神经元活动或短暂N-甲基-D-天冬氨酸受体激活诱导的AIS可塑性是一个钙依赖性过程。更极端的AIS可塑性诱导方案表明，AIS解聚需要蛋白酶体参与。很可能线粒体在重塑过程中停靠在AIS细胞骨架位点。一个有趣的实验将是在遗传沉默MCU的同时，在皮层L2/3细胞（与L5细胞不同，它们在正常情况下表现出结构性AIS可塑性）中于AIS可塑性期间对mt-GFP进行成像。

AIS线粒体可能在维持轴突完整性方面发挥重要作用，并在脱髓鞘和/或神经退行性疾病等病理条件下变得关键。支持这一观点的是，在损伤模型和肌萎缩侧索硬化症中，细胞器在AIS内的数量和大小增加，并积累在AIS远端。在脱髓鞘轴突中，线粒体锚定蛋白syntaphilin是线粒体固定、聚集和体积增大所必需的。病理条件下的AIS线粒体可能支持神经元兴奋性的适应或指导轴突货物运输。例如，在肌萎缩侧索硬化症中，运动神经元在AIS积累线粒体，其特征是AIS长度缩短和兴奋性降低。神经损伤通常诱导蛋白酶体介导的AIS解聚以及随后线粒体向远端轴突运输以支持损伤修复。有趣的是，这一过程在肌萎缩侧索硬化症小鼠模型中被破坏。AIS线粒体先前被描述为控制TAU蛋白的运输，表明其他轴突货物的运输也可能受AIS线粒体调节。AIS完整性、线粒体和轴突损伤之间复杂且双向的相互作用仍有待进一步研究。在神经元中增强线粒体Ca²⁺缓冲可缓解癫痫症状，其中AIS的线粒体Ca²⁺缓冲可能参与其中。

总之，当前研究结果表明，L5锥体神经元在微区水平上调节其轴突线粒体含量，线粒体聚集在AIS近端，但对于维持正常水平的膜兴奋性是非必需的。这些发现为探索线粒体在可塑性和病理过程中AIS（解）组装和维持的作用开辟了新的途径。