《The Journal of Physiology》：Characterization of postnatal brain injury and behavioural deficits in a rat model of placental insufficiency-induced fetal growth restriction
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本研究首次系统性揭示，在大鼠子宫灌注压降低（RUPP）模型中，胎盘功能不全诱导的胎儿生长受限（FGR）可引起子代产后脑损伤（表现为脑体积/重量降低、皮质变薄、髓鞘形成异常、小胶质细胞激活、少突胶质细胞成熟阻滞、皮质内中间神经元分布紊乱）及持续性神经发育延迟与运动缺陷。该模型为深入理解FGR相关脑损伤机制、开发改善神经发育结局的新疗法提供了重要工具。
引言
胎儿生长受限（Fetal Growth Restriction, FGR）是一种常见的妊娠并发症，每年影响全球约3000万新生儿，是围产期发病率和死亡率的第二大原因。FGR主要由胎盘功能不全引起，导致胎儿氧气和营养供应减少。尽管胎儿可能存在“脑保护”效应（即血流优先供应大脑），但FGR婴儿仍面临神经发育障碍的高风险，包括运动、认知和行为缺陷。目前，尚缺乏支持FGR婴儿大脑发育的有效疗法。为了开发针对性的治疗策略，深入了解FGR相关脑结构及功能异常至关重要。临床研究报道FGR与大脑结构异常相关，包括脑体积减小、灰质体积减少、皮质变薄、脑回异常以及白质（White Matter, WM）异常。其中，白质异常常与少突胶质细胞成熟受阻相关，而少突胶质前体细胞对缺氧和炎症（FGR的关键致病事件）敏感。在FGR动物模型中，小胶质细胞表现出更强的免疫反应表型，产生促炎细胞因子，这可能进一步加剧少突胶质细胞成熟停滞。实验模型对于阐明FGR相关脑损伤机制不可或缺。其中，子宫灌注压降低（Reduced Uterine Perfusion Pressure, RUPP）大鼠模型可诱导胎盘功能不全相关的FGR，模拟了母体子痫前期和子代FGR的表型。尽管RUPP模型被广泛用于研究子痫前期和胎儿发育，但其对子代产后大脑发育的影响此前尚未被系统研究。本研究旨在首次全面表征RUPP子代在大体解剖、细胞和功能水平上的大脑发育情况，并评估其神经发育结局。
方法
本研究获得了相关动物伦理委员会的批准。使用妊娠的Sprague-Dawley大鼠，在胚胎第14天（Embryonic day 14, E14）对孕鼠进行手术，构建RUPP模型。具体方法是在腹主动脉下段和双侧卵巢动脉放置银夹，以减少子宫灌注压。假手术组（Sham）作为对照。子代大鼠出生后（出生日计为Postnatal day 0, P0）进行体重监测直至P66-67，并进行一系列行为学测试。在P20时，一部分动物被用于组织学（免疫组化）和磁共振成像（Magnetic Resonance Imaging, MRI）评估。组织学分析包括测量皮质厚度、COUP-TF相互作用蛋白2（COUP-TF Interacting Protein 2, CTIP2）阳性层厚度（标记深层皮质V-VI层）、髓鞘碱性蛋白（Myelin Basic Protein, MBP）染色分析髓鞘形成、少突胶质细胞转录因子2（Oligodendrocyte Transcription Factor 2, OLIG2）和抗腺瘤性息肉病蛋白（anti-Adenomatous Polyposis Coli, CC1）染色评估少突胶质细胞谱系及成熟情况、小清蛋白（Parvalbumin, PV）阳性中间神经元计数与分布、以及离子钙结合衔接分子1（Ionized Calcium-Binding Adapter Molecule 1, IBA1）染色评估小胶质细胞数量与形态。MRI用于评估全脑体积、皮质体积，并进行扩散张量成像（Diffusion Tensor Imaging, DTI）和加速显微结构成像（Accelerated Microstructure Imaging via Convex Optimization, AMICO）分析，以获得分数各向异性（Fractional Anisotropy, FA）、取向分散指数（Orientation Dispersion Index, ODI）等微观结构参数。行为学评估分为新生儿期（至P20）和长期（至P66-67）两套测试方案，包括负趋地性、寻巢行为、超声波发声、睁眼时间、抓握力、社交游戏、旷场实验和锥形横梁行走测试，以全面评估神经发育、感觉运动功能、社会行为和运动协调能力。
结果
- 1.
FGR表型在RUPP子代中成功诱导：RUPP孕鼠产下的活仔数减少，胎儿吸收率增高。在P20时，RUPP子代表现出体重、脑重和MRI脑体积均显著降低，且脑重与体重比值升高，提示存在“脑保护”现象。从出生到成年（P66-67），RUPP子代体重持续低于假手术组，未见追赶性生长。
- 2.
RUPP子代出现大脑皮质变薄与结构紊乱：MRI显示RUPP子代皮质体积减小。组织学分析进一步证实，在运动皮质和初级体感皮质，RUPP子代的总体皮质厚度均变薄。更重要的是，在运动皮质（而非体感皮质），RUPP子代表现出皮质分层结构的改变：深层（CTIP2+）皮质增厚，而浅层（CTIP2-）皮质变薄。此外，虽然运动皮质和海马中PV+中间神经元的总数无差异，但RUPP子代运动皮质中PV+神经元的分布发生改变，尤其是在浅层与深层皮质交界处以及皮质最表层区域。
- 3.
RUPP子代呈现异常的髓鞘形成模式：对运动皮质的髓鞘分析发现，RUPP子代皮质深层区域的MBP+面积百分比更高，即存在深层皮质的高髓鞘化。进一步的微观结构分析显示，在深层皮质，RUPP子代的髓鞘纤维互连数量、纤维长度、连接点和分支数量均增加，表明髓鞘复杂性增高；而在浅层皮质，互连纤维数量减少。MRI扩散分析显示，在胼胝体（Corpus Callosum, CC）的吻侧部分，RUPP子代的FA降低，且整个胼胝体的ODI增高，表明白质束完整性下降和结构紊乱增加。组织学测量也发现RUPP子代吻侧胼胝体增厚。
- 4.
RUPP子代存在少突胶质细胞成熟阻滞：尽管运动皮质中少突胶质细胞（OLIG2+）总数无差异，但RUPP子代浅层皮质的少突胶质细胞密度增加。关键的是，RUPP子代表现出成熟的髓鞘形成少突胶质细胞（CC1+/OLIG2+）比例显著降低，这种现象在浅层和深层皮质中均存在，表明少突胶质细胞成熟过程受阻。
- 5.
RUPP子代在运动皮质、海马和第三脑室周围出现神经炎症迹象：RUPP子代运动皮质中小胶质细胞（IBA1+）数量无变化，但其形态学指标（包括IBA1+面积减小、圆形度增加、Feret直径减小）均指向更活跃的免疫反应表型。在第三脑室周围，RUPP子代不仅IBA1+细胞数量增多，也显示出激活的形态学特征（面积减小，Feret直径减小）。在海马的不同亚区（齿状回、CA2、CA3），RUPP子代的小胶质细胞同样表现出激活的形态，但在CA1区未见显著差异。
- 6.
RUPP子代表现出神经发育延迟和持续至成年期的运动缺陷：行为学测试表明，RUPP子代在新生儿期即出现多种异常：P6时负趋地性转身延迟且跌倒次数更多；P10时超声波发声数量增多；P15时睁眼延迟；P17时抓握力减弱（且与体重无关）。在青少年期（P33-35），RUPP与假手术组在社交游戏行为上无差异。在成年早期（P39-40），旷场实验显示两组在自主活动量和焦虑样行为上无差异。然而，在成年期（P58-63）进行的锥形横梁行走测试中，RUPP子代表现出运动协调和平衡能力受损，其累计全足滑步比率显著高于假手术组。
讨论
本研究首次证实，RUPP大鼠模型不仅能诱导FGR表型，还能引起子代产后广泛的脑损伤和持久的行为异常。这些损伤包括脑体积减小、皮质变薄和结构紊乱、异常的髓鞘形成（深层皮质高髓鞘化伴复杂性增加，但少突胶质细胞成熟受阻）、皮质中间神经元分布异常、多个脑区的神经炎症激活、以及从新生儿期持续至成年期的神经发育延迟和运动协调缺陷。
研究发现RUPP子代出现的“脑保护”（脑重/体重比升高）与临床不对称性FGR特征一致。尽管存在可能的脑保护，RUPP仍导致了包括皮质变薄在内的脑损伤，这与临床FGR患儿的影像学发现相符。皮质分层结构（CTIP2+/CTIP2-层比例改变）和PV+中间神经元分布的紊乱，可能反映了在RUPP手术关键期（E14，正值皮质神经元和胶质细胞迁移活跃阶段）的发育干扰，这可能会影响皮质环路的功能连接。
髓鞘形成的异常尤为复杂。RUPP子代表现出深层皮质的“高髓鞘化”和复杂性增加，但少突胶质细胞成熟比例却降低，同时胼胝体FA降低、ODI升高提示白质完整性受损。这可能是由于缺氧、炎症等损伤因素破坏了少突胶质细胞正常的发育轨迹，导致髓鞘形成紊乱，而非单纯的髓鞘形成不足或延迟。小胶质细胞的激活形态在多个脑区被观察到，其产生的促炎环境可能进一步抑制少突胶质细胞的成熟，加剧髓鞘异常。
行为学表型与观察到的脑结构异常相呼应。新生儿期的运动协调缺陷（负趋地性）、沟通异常（超声波发声增多）、发育里程碑延迟（睁眼）和肌力减弱，与皮质、白质及小脑等运动相关通路的损伤可能有关。最重要的是，在新生儿期出现的运动缺陷（抓握力弱）延续并发展为成年期更复杂的运动协调障碍（横梁行走测试表现差），这强烈提示RUPP诱导的FGR引起的脑损伤并非短暂的围产期事件，而是导致了长期的神经系统脆弱性，与FGR患儿远期出现神经发育问题的临床观察高度一致。
总之，本研究系统地表征了RUPP大鼠模型子代的脑发育和行为结局，揭示了FGR导致神经发育损害的潜在细胞和结构机制。该模型成功模拟了临床FGR的多种关键特征，为未来研究FGR相关脑损伤的病理生理机制、以及测试旨在改善长期神经发育结局的新型干预措施（如抗炎治疗、促进髓鞘修复等）提供了一个高度转化价值的临床前平台。
