《Microbial Biotechnology》：Efficient Extracellular Production of Insulin Glargine in Trichoderma reesei by an Integrative Secretion-Based Strategy
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本文综述了利用工业丝状真菌瑞氏木霉(Trichoderma reesei)作为新型表达宿主，高效分泌生产长效胰岛素类似物胰岛素格列本脲(Insulin glargine)的系统性优化策略。文章重点阐述了通过融合蛋白策略（特别是与CBH1融合）、优化信号肽（如使用黑曲霉β-葡萄糖苷酶信号肽AnG）来减轻内质网(ER)应激、增强内质网未折叠蛋白反应(UPR)并规避内质网相关降解(ERAD)通路，从而成功实现格列本脲胞外分泌的完整过程，最终在摇瓶培养中获得58.95 mIU/L的产量。该研究为在瑞氏木霉中生产格列本脲等复杂治疗性重组蛋白提供了一个极具潜力的高效分泌平台，具有重要的工业应用前景。
1 引言
自1922年胰岛素首次临床应用以来，它已被用作治疗多种形式糖尿病(DM)的降糖药物。随着糖尿病发病率迅速上升，对胰岛素的需求日益增加。胰岛素格列本脲是一种长效胰岛素类似物，能降低低血糖风险，使糖尿病患者能够以较低的注射频率妥善管理血糖水平。与传统的胰岛素相比，格列本脲在A链A21位以甘氨酸取代天冬酰胺，并在B链C末端增加了两个精氨酸(RR)残基。这些改变将胰岛素的等电点从5.4移至6.7，显著增强了其化学稳定性。
目前，胰岛素的工业生产主要依赖于大肠杆菌(E. coli)和哺乳动物细胞，两者都有明显的局限性。大肠杆菌系统涉及复杂且可能使蛋白变性的步骤，而哺乳动物细胞系统则受限于高培养成本和长发酵周期。这些挑战突显了开发具有高分泌效率和高精度加工能力的真核表达系统的迫切需要。因此，探索和改造具有稳健生长、代谢多功能性和卓越工业生物生产能力的非传统微生物宿主，越来越受到关注。
瑞氏木霉是一种公认安全(GRAS)的丝状真菌，具有卓越的蛋白质分泌能力（产量超过100 g/L）和成熟的工业发酵特性。其真核翻译后修饰系统能够合成类似哺乳动物的糖基化前体(GlcNAc2Man5)，并已成功用于生产多种复杂的治疗性蛋白。结合其固有的利用低成本木质纤维素水解物的能力，瑞氏木霉在重组蛋白生产方面具有比酵母更先进的翻译后修饰系统和多种独特优势。
本研究旨在建立瑞氏木霉中格列本脲的分泌生产平台。我们合理设计了融合蛋白，筛选了最佳信号肽，并引入了Kex2蛋白酶(Kex2p)切割位点以实现B链RR残基的精确C端加工，从而规避了传统胰蛋白酶消化相关的杂质问题。同时，分析了内质网(ER)中的未折叠蛋白反应，以阐明宿主对异源蛋白表达的适应机制。通过优化分泌途径和减轻内质网应激，本研究不仅显著提高了格列本脲的产量和质量，还为开发瑞氏木霉作为治疗性蛋白的高效可靠生产宿主提供了有力策略。
2 材料与方法
本研究使用了瑞氏木霉菌株QP4，它是从瑞氏木霉菌株QM9414衍生而来的pyrG阴性突变株，既作为亲本也作为对照株。通过将构建的表达盒与pyrG盒共同转化到瑞氏木霉QP4菌株的原生质体中来获得重组菌株。转化子在不含尿嘧啶的基本培养基(MM)平板上筛选，并通过PCR确认。使用了摇瓶培养和生物反应器发酵两种培养方法。采用RT-qPCR检测基因转录水平，使用Tricine-SDS-PAGE分析分泌蛋白，通过LC-MS/MS鉴定目标蛋白，并利用人胰岛素格列本脲ELISA试剂盒测定发酵上清液中的格列本脲浓度。
3 结果
3.1 利用强启动子Pcdna1在瑞氏木霉中生产格列本脲
研究探索了格列本脲在瑞氏木霉中的两种表达形式：(i) 作为不含连接肽的A链和B链组成的分泌单链表达；(ii) 在格列本脲的A链和B链之间插入一个迷你C肽(AAK)。采用了强组成型启动子Pcdna1以实现在不同培养条件下的持续高水平表达，并利用内源性CBH1信号肽(SP1)来促进高效的分泌途径参与。构建了两种不同的格列本脲表达盒，并与pyrG盒共转化到瑞氏木霉QP4菌株中。通过RT-qPCR检测，发现不含迷你C肽的菌株S1r转录水平更高。然而，Tricine-SDS-PAGE分析未在发酵上清液中检测到格列本脲目标条带，表明在不添加载体蛋白的情况下直接在瑞氏木霉中表达格列本脲是不可行的。
3.2 格列本脲表达菌株在瑞氏木霉中引发的内质网应激
在瑞氏木霉中，新合成的蛋白质进入内质网分泌途径以获取活性并转运至最终目的地。然而，目标蛋白的异常折叠特性或高水平蛋白生产会导致错误折叠甚至聚集的蛋白在内质网中积累，从而引发内质网应激，并触发未折叠蛋白反应(UPR)和内质网相关降解(ERAD)途径，导致所需蛋白质无法有效分泌。为了确定在生产格列本脲期间是否引发内质网应激，检测了S1r和S1CHr菌株中参与UPR（pdi1和bip1）和ERAD途径（hrd1和der1）的关键成分编码基因的转录水平。结果发现，在S1r菌株中，bip1和pdi1的转录水平显著上调，而在S1CHr菌株中未检测到相同现象。此外，在两个重组菌株中，hrd1和der1的转录水平均有所增加，表明ERAD途径被显著激活。这些转录结果表明，格列本脲的异源表达很可能引发了内质网应激，从而激活了ERAD途径进行前体降解。这进一步暗示格列本脲可能在瑞氏木霉的内质网中错误折叠或以其他方式损害了其折叠。
3.3 应用载体蛋白融合策略促进格列本脲分泌
由于直接表达格列本脲会引起强烈的内质网应激，表明瑞氏木霉无法为其正确折叠提供最佳环境。在瑞氏木霉蛋白生产系统中，载体蛋白融合通过将目标蛋白附着在分泌的真菌蛋白上来增强其高效分泌。选择了两种在诱导条件下高表达的内源性分泌酶，连同合成的前导肽(LA-20)作为格列本脲的载体蛋白。这些包括带有其接头区域的CBH1催化域(CBH1载体)和含有其接头的CBH2纤维素结合域(CBH2载体)。为了引导融合蛋白通过瑞氏木霉分泌途径并实现高效切割，将格列本脲以“载体蛋白-KR-格列本脲”的格式连接到载体蛋白，其中KR基序(NVISKR)作为潜在的Kex2p加工位点。将构建的表达盒与pyrG盒共同转入瑞氏木霉QP4菌株，分别将携带CBH1载体、CBH2载体和LA-20的菌株命名为S1C1r、S1C2r和S1CLr。RT-qPCR定量显示，格列本脲和载体蛋白在这些菌株中均有组成型转录。
随后，使用Tricine-SDS-PAGE分析S1C1r、S1C2r和S1CLr菌株的发酵培养物。在S1C1r的培养上清液中检测到一个约6.0 kDa的多肽，与预测的格列本脲分子量(6.06 kDa)相符。在S1C2r、S1CLr和QP4菌株的培养上清液中未出现预期大小的条带。这表明该多肽是包含B链和A链的胰岛素原格列本脲。对发酵不同天数的S1C1r菌株培养上清液进一步进行Tricine-SDS-PAGE分析，发现目标条带在发酵第2至5天可见。此外，LC-MS/MS鉴定进一步证实了大小为6.0 kDa的条带是格列本脲。同时，还检测到一个约49.0 kDa的清晰条带，推测是CBH1载体。另外，使用人G-INS ELISA试剂盒测量了S1C1r发酵第3天上清液中的格列本脲浓度，显示浓度约为14.43 mIU/L。这些结果表明，使用CBH1载体、Kex2接头以及SP1可以促进格列本脲的分泌生产。
3.4 格列本脲表达菌株在瑞氏木霉中的内质网应激反应
为了研究所选载体蛋白对内质网应激激活的影响及其在格列本脲分泌中的作用，使用RT-qPCR定量了UPR和ERAD相关基因的转录水平。结果发现，S1C1r菌株的bip1和pdi1转录水平增加，而ERAD相关基因（der1和hrd1）的转录水平没有升高。这些结果表明，在S1C1r中与CBH1载体融合的格列本脲分泌表达触发了UPR，但未激活ERAD途径进行蛋白质降解，从而使得格列本脲能够分泌而不在细胞内被降解。此外，S1C2r和S1CLr菌株的UPR相关基因转录水平显著高于亲本菌株。与对照相比，S1C2r和S1CLr菌株的ERAD相关基因转录水平有不同程度的增加。观察到的UPR和ERAD相关基因转录上调与这些菌株在生产格列本脲期间激活这些途径的情况一致。这种激活可能与在这些菌株中观察到的降解一致。综上所述，数据表明CBH1载体可能比CBH2载体和LA-20更有效地减轻内质网应激，而后两者均未显示出显著的缓解作用。
3.5 利用替代信号肽设计优化格列本脲的分泌生产
考虑到信号肽(SPs)分泌重组蛋白的效率存在差异，为给定蛋白质选择合适的信号肽至关重要。为了获得格列本脲分泌的有效信号肽，我们通过替换初始的SP1测试了三种不同的真菌信号肽：AnG（来自黑曲霉的β-葡萄糖苷酶信号肽）、AnA（来自泡盛曲霉的α-淀粉酶信号肽）和SP2（来自瑞氏木霉的CBH2信号肽）。构建了包含三种不同信号肽的表达盒，并与pyrG盒共同转化到瑞氏木霉QP4菌株中。随后，候选转化子在以2%葡萄糖为碳源的发酵培养基中培养，以确定其生产格列本脲的能力。通过RT-qPCR检测格列本脲的转录水平。对于每个表达盒，选择格列本脲转录水平最高的转化子用于后续研究，分别称为SGC1r (AnG)、SAC1r (AnA)和S2C1r (SP2)。同时，检测了各菌株CBH1载体的转录水平。结果发现，SGC1r和S2C1r菌株的格列本脲和CBH1载体转录水平都很高，而SAC1r菌株两者的转录水平都很低。通过Tricine-SDS-PAGE分析这些菌株的分泌蛋白。结果显示，在SGC1r中观察到一个约6.0 kDa的条带，随后通过LC-MS/MS分析鉴定为格列本脲。相比之下，在另外两个菌株中未观察到相应的条带。此外，使用人G-INS ELISA试剂盒测量了培养上清液中的格列本脲浓度。SGC1r培养上清液中的格列本脲含量约为58.95 mIU/L，几乎是S1C1r菌株的四倍。当在控制参数（30°C, 400 rpm, 1.0 vvm, pH 3–5）下放大到1 L生物反应器时，SGC1r菌株实现了144.75 mIU/L的格列本脲产量，证实了其在工业相关条件下增强的生产性能。
此外，还进行了UPR和ERAD相关基因的转录分析。结果显示，在SGC1r和S2C1r中观察到bip1和pdi1的高转录水平，而SAC1r中bip1和pdi1的转录水平与亲本菌株相比似乎没有差异。这表明UPR也在SGC1r和S2C1r菌株中被引发。在工程菌株中，ERAD相关基因的表达水平与亲本菌株QP4相比没有统计学上的显著差异。因此，数据可以得出结论，这些基因在任何一个菌株中都没有被显著激活，表明ERAD途径可能没有被基因改造引发。总而言之，使用AnG信号肽可能与增强的格列本脲分泌相关，而没有大量诱导内质网应激。这些结果表明，AnG信号肽与CBH1载体结合可被视为促进瑞氏木霉生产格列本脲的一种有前景的策略。
4 讨论
在本研究中，我们通过一个专注于融合伴侣、信号肽和内质网稳态的整合策略，在瑞氏木霉中建立了一个高效的格列本脲分泌生产系统。融合伴侣的选择对成功分泌至关重要，在测试的候选者中，CBH1载体的格列本脲滴度最高。通过删除CBH1的C末端PGP序列对其进一步改造，以减少Kex2切割位点附近潜在的结构刚性，从而可能提高切割效率。值得注意的是，在S1C1r菌株中表达CBH1-格列本脲融合蛋白激活了UPR，如bip1和pdi1基因的上调所示，但未引发ERAD途径。这种模式表明，CBH1载体在一定程度上促进了正确折叠，使得UPR激活足以恢复内质网稳态，从而无需进行强有力的ERAD介导的降解。相比之下，表达与CBH2载体或LA-20融合的菌株则表现出UPR和ERAD基因的上调，表明诱导了内质网应激，这可能导致蛋白质折叠受损。这与它们较差的分泌性能是一致的。
除了融合伴侣，分泌信号肽也显著影响生产水平。用AnG信号肽替换天然信号（菌株SGC1r）使格列本脲分泌比基础构建体增强了4.09倍。这种增加伴随着UPR的激活，意味着更高的蛋白质通量进入内质网需要增强的折叠能力。重要的是，没有一个信号肽变体触发ERAD途径，这证实了CBH1载体在不同的分泌背景下有效地支持了格列本脲的折叠。SAC1r菌株未能激活UPR，可能归因于融合蛋白的转录丰度不足以超过内质网应激信号传导的阈值。
遇到的一个关键挑战是分泌的格列本脲的蛋白水解降解。在培养上清液中添加苯甲基磺酰氟(PMSF)稳定了产物，证实了瑞氏木霉分泌的内源性蛋白酶构成了一个重大障碍。未来的工作将受益于使用蛋白酶缺陷型菌株。最后，这些结果表明，主要的分泌产物是单链格列本脲，而不是成熟的双链形式，这已通过Tricine-SDS-PAGE得到证实。虽然内源性Kex2p是一种有效的蛋白酶，可在真核生物中切割融合蛋白，但其活性被证明不足以完全处理瑞氏木霉中格列本脲工程化Kex2p切割位点，这可能源于Kex2p受限的蛋白酶特异性或底物界面处的空间限制，这是真菌表达系统中公认的局限性。毫无疑问，通过共表达Kex2p蛋白酶或改造切割位点来增强蛋白水解加工能力仍然是必要的。
然而，应该指出的是，本研究报告的格列本脲产量（58.95 mIU/L）大大低于目前基于大肠杆菌或哺乳动物细胞的工业平台（通常是IU/mL水平）。这主要是因为目前的菌株代表了一个基础工程底盘，主要是为了验证在瑞氏木霉中异源表达复杂蛋白药物格列本脲的可行性。目前格列本脲的高产工业菌株，如大肠杆菌或CHO细胞，是数十年长期定向进化和系统工程优化的结果。因此，本研究的意义在于提供了概念验证，证明瑞氏木霉具有表达和分泌复杂胰岛素类似物的能力，这有助于扩大生产蛋白药物的工业菌株来源。
未来可以通过几个综合策略来提高瑞氏木霉中格列本脲的产量：(i) 共表达分子伴侣，如Bip1和PDI，可直接提高蛋白质折叠效率并减轻内质网应激，从而增加功能蛋白的分泌产量；(ii) 系统代谢工程优化关键前体（如乙酰辅酶A、氨基酸）和辅因子的供应，确保高效生物合成有充足的资源和能量；(iii) 先进的发酵优化涉及补料分批策略和对关键参数（如溶解氧、pH）的精确控制，从而最大限度地提高生物反应器中的生产规模和总滴度。总而言之，这些方法为在微生物系统中提高复杂蛋白治疗药物的制造效率提供了一条全面的路线图。
总之，我们的研究结果表明，强组成型启动子、CBH1载体蛋白和AnG信号肽的合理整合为瑞氏木霉生产格列本脲产生了协同效应，主要是通过调节内质网应激来规避降解途径。这种整合的分泌策略为在这种真菌宿主中生产其他复杂的治疗性蛋白提供了一个有价值的框架。
