《MicrobiologyOpen》：Sequence-Based and Functional Analysis for the Discovery of N-Glycan Degrading Glycosidases From the Microbial Metagenome of the Infant Gut
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本文通过序列分析与功能验证，系统挖掘了母乳喂养婴儿肠道微生物宏基因组中参与N-聚糖降解的关键糖苷酶（包括GH2 β-半乳糖苷酶、GH20 外切-N-乙酰葡糖胺糖苷酶和GH18 内切-N-乙酰葡糖胺糖苷酶），揭示了其对糖复合物的底物特异性，为理解婴儿肠道菌群定植、膳食与宿主来源聚糖的利用提供了新见解。
引言
黏膜与人乳糖蛋白参与多种生物学功能，包括病原体感染和肠道微生物组成。N-聚糖通过N-糖苷键连接至蛋白质的天冬酰胺残基，其核心为五糖结构（两个GlcNAc和三个甘露糖），可延伸形成高甘露糖型、复杂型和杂合型N-聚糖。人乳寡糖（HMOs）在婴儿肠道菌群定植中起重要作用，但糖苷酶对糖复合物（如糖蛋白）的降解机制尚不明确。内切-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶（ENGases）可水解N-聚糖核心的N,N'-二乙酰壳二糖（ChbNAc），而外切糖苷酶（如GH2 β-半乳糖苷酶、GH20 外切-N-乙酰葡糖胺糖苷酶）则逐步去除天线结构中的单糖。本研究旨在通过婴儿肠道微生物宏基因组分析，鉴定并功能表征参与N-聚糖降解的GH2、GH20和GH18家族糖苷酶。
材料与方法
利用dbCAN2服务器对母乳喂养婴儿粪便样本的宏基因组序列进行注释，预测GH2、GH20和GH18家族糖苷酶基因。通过SignalP 5.0筛选含信号肽的酶，并进行克隆、表达与纯化。酶活性通过高效液相色谱（HPLC）测定，底物包括G2肽、糖蛋白（如RNase B、胎球蛋白、去唾液酸胎球蛋白、IgG、乳铁蛋白）及游离寡糖（如乳糖、N-乙酰乳糖胺、GlcNAcβ1-2甘露糖）。动力学参数以对硝基苯酚衍生物（pNP-Gal、oNP-GlcNAc）为底物测定。
结果
3.1 婴儿肠道微生物宏基因组中参与N-聚糖降解的假定糖苷酶挖掘
宏基因组分析共鉴定出114个GH2、52个GH20和15个GH18假定糖苷酶，其中66个GH2、20个GH20和8个GH18含有预测信号肽。序列同源性分析显示，这些酶与拟杆菌（Bacteroides）、双歧杆菌（Bifidobacterium）、肠球菌（Enterococcus）等肠道细菌的糖苷酶高度相似。结构域分析表明，GH2酶包含催化结构域Glyco_hydro_2_C和Bgal_Small_N；GH20酶均含Glyco_hydro_20催化结构域；GH18酶中部分为内切-N-乙酰葡糖胺糖苷酶，部分为几丁质酶。最终选择Gal1b、Gal99等9个GH2，Exo10a、Exo360等6个GH20，以及Endo38、Endo358等3个GH18酶进行功能表征。
3.2 婴儿肠道微生物宏基因组来源的GH2糖苷酶对糖复合物的活性
纯化的GH2 β-半乳糖苷酶中，Gal1b和Gal99能够从G2肽和去唾液酸胎球蛋白中去除β1,4连接的半乳糖，且对含唾液酸的胎球蛋白无活性，表明唾液酸阻碍其作用。Gal1b、Gal25、Gal37c、Gal99和Gal296可水解乳糖和N-乙酰乳糖胺，说明其特异性针对β1,4连接至葡萄糖或GlcNAc的半乳糖。其他GH2酶对糖蛋白无显著活性。
3.3 婴儿肠道微生物宏基因组来源的GH20糖苷酶对糖复合物的活性
所有GH20外切-N-乙酰葡糖胺糖苷酶均可水解二糖GlcNAcβ1-2甘露糖。Exo10a、Exo38和Exo360在G2肽经Gal1b预处理后，能去除β1,2连接的GlcNAc。Exo360可同时水解核心甘露糖α1,3和α1,6分支的GlcNAc，而Exo10a更倾向于单一分支。Exo38和Exo360对Gal1b预处理后的去唾液酸胎球蛋白也显示活性。
3.4 婴儿肠道微生物宏基因组来源的GH18糖苷酶对糖复合物的活性
Endo38能够从高甘露糖型糖蛋白RNase B和乳铁蛋白中释放完整的N-聚糖。Endo358可作用于非唾液酸化复杂型N-聚糖（如去唾液酸胎球蛋白），但不能水解核心岩藻糖基化的N-聚糖。此外，Endo358可将四乙酰壳四糖水解为壳二糖，显示内切几丁质酶活性。
讨论
婴儿肠道菌群的组成对其发育至关重要。本研究发现，多形拟杆菌（Bacteroides thetaiotaomicron）来源的GH2和GH20糖苷酶（如Gal1b、Exo360）具有新颖的序列特征，拓宽了该菌降解复杂N-聚糖的酶工具箱。Massiliensis巨球形菌（Megasphaera massiliensis）来源的Endo358是首个在该菌中表征的糖苷酶，其活性提示该菌可能通过降解GlcNAc衍生聚糖产生短链脂肪酸。值得注意的是，双歧杆菌（Bifidobacterium）在预测分泌型糖苷酶中占比低，与其基因组中GH2、GH20、GH18基因较少且多位于胞内相符。此外，本研究鉴定的糖苷酶在生物技术领域具应用潜力，如Gal1b和Gal99可用于糖蛋白半乳糖修饰，Exo10a可制备不对称N-聚糖结构，GH20和GH18家族的转糖基活性亦可用于寡糖合成与糖蛋白重塑。
结论
本研究通过序列与功能分析，揭示了婴儿肠道微生物宏基因组中GH2、GH20和GH18家族糖苷酶的多样性及其在N-聚糖降解中的特异性作用。GH2 β-半乳糖苷酶（Gal1b、Gal99等）可去除半乳糖；GH20外切-N-乙酰葡糖胺糖苷酶（Exo10a、Exo360等）能水解GlcNAcβ1-2甘露糖及糖复合物中的GlcNAc；GH18内切-N-乙酰葡糖胺糖苷酶（Endo38、Endo358）可释放完整N-聚糖。这些发现深化了对婴儿肠道菌群利用膳食与宿主来源聚糖机制的理解，并为相关酶工具的开发提供了资源。
