GhSTH-2：整合宿主氧化还原信号与效应子识别，赋予棉花对大丽轮枝菌的抗性

《Molecular Plant Pathology》：GhSTH-2 Integrates Host Redox Signalling and Effector Recognition and Confers Resistance Against Verticillium dahliae in Cotton

这篇研究性论文（非综述）揭示了棉花PR10/Bet v1-like家族成员GhSTH-2在调控抗病性中的核心作用。研究发现，GhSTH-2能通过直接结合病原体效应蛋白VdEPG1和宿主氧化还原相关蛋白GhTXNDC9，正调控活性氧（ROS）信号通路，从而增强棉花对大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）的抗性。该研究为深入理解植物免疫互作机制和培育抗黄萎病棉花新品种提供了关键分子靶点。

　　

1. 引言

棉花（Gossypium spp.）作为全球最重要的天然纤维作物，其生产受到大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）引起的黄萎病的严重威胁。该土传真菌病原体可长期以微菌核形态在土壤中存活，并通过分泌效应蛋白等策略抑制宿主免疫，导致维管束堵塞、萎蔫、植株死亡、产量和纤维品质下降。尽管育种取得了一定进展，但缺乏稳定、高抗的种质资源仍是主要挑战，因此，鉴定宿主防御途径中的关键抗性基因至关重要。

植物的先天免疫系统包括模式触发免疫（PTI）和效应子触发免疫（ETI）。在免疫反应中，活性氧（ROS）信号起着核心作用，是细胞响应不同刺激的关键信号分子。活性氧的主要形式包括过氧化氢（H₂O₂）、超氧阴离子（O₂^•?）等，其爆发主要由呼吸爆发氧化酶同系物（RBOHs，如RBOHD）介导。活性氧稳态的维持涉及复杂的调控网络，其中硫氧还蛋白（TRXs）通过催化二硫键还原，在维持细胞内氧化还原稳态和调节免疫信号中发挥核心作用。

病程相关（PR）蛋白是植物防御反应的关键介质。PR10/Bet v1-like蛋白家族是PR蛋白的一个重要类别，在植物防御和生长过程中扮演着关键角色。例如，早期表达PR-10可增强棉花对黄萎病的抗性。本研究聚焦于棉花PR10/Bet v1-like蛋白家族成员GhSTH-2，探究其在棉花抵抗大丽轮枝菌侵染中的功能与机制。

2. 结果

2.1 GhSTH-2基因克隆与生物信息学分析

前期转录组分析发现，GhSTH-2及其同源基因在大丽轮枝菌侵染早期被显著上调。系统发育分析表明，GhSTH-2与MLP亚家族成员亲缘关系密切。多重序列比对揭示了包括甘氨酸富集环和保守的Bet_v_1结构域在内的共同特征，表明其可能在分子互作或应激反应中发挥基本功能。

2.2 沉默GhSTH-2削弱棉花对大丽轮枝菌的防御反应

利用病毒诱导的基因沉默（VIGS）技术降低棉花中GhSTH-2的表达。与对照相比，GhSTH-2沉默植株在接种大丽轮枝菌后表现出更严重的萎蔫、叶片黄化、落叶和株高降低，病害指数更高。组织学分析显示，沉默植株的维管束褐变更严重，木质素沉积减少，真菌生物量更高。更重要的是，沉默植株的活性氧爆发能力显著减弱，H₂O₂含量降低，活性氧相关基因（GhRBOHA和GhRBOHD）以及多个防御相关基因、木质素生物合成途径关键基因的表达均显著下调。这些结果表明，GhSTH-2是棉花防御反应的正调控因子，尤其通过调控活性氧信号发挥作用。

2.3 亚细胞定位

通过农杆菌介导的瞬时表达，将GhSTH-2-GFP融合蛋白在本氏烟草叶片中表达。与细胞核标记CBF1-RFP和细胞膜标记H2B-RFP共定位分析表明，GhSTH-2同时定位于细胞膜和细胞核。

2.4 GhSTH-2与VdEPG1相互作用

VdEPG1是大丽轮枝菌糖苷水解酶28家族（GH28）的一个成员，作为一种毒性因子，可抑制植物免疫途径。通过酵母双杂交（Y2H）、双分子荧光互补（BiFC）和荧光素酶互补成像（LCI）实验，证实了GhSTH-2与VdEPG1之间存在直接的蛋白质相互作用。进一步的截短体实验表明，GH28结构域内的第235-271位氨基酸是介导GhSTH-2–VdEPG1相互作用的关键区域。

2.5 GhSTH-2与GhTXNDC9相互作用

为了探索GhSTH-2的作用机制，以其为诱饵蛋白进行酵母双杂交筛库，鉴定出氧化还原相关蛋白GhTXNDC9（含硫氧还蛋白结构域）是其互作蛋白。该相互作用随后通过LCI和BiFC实验在本氏烟草叶片中得到验证。这表明GhSTH-2可能通过与GhTXNDC9的相互作用参与细胞内氧化还原反应，从而在活性氧相关信号通路中发挥作用。

2.6 ΔVdEPG1侵染减弱活性氧产生并下调GhSTH-2和GhTXNDC9表达

利用VdEPG1基因敲除突变体（ΔVdEPG1，其毒力显著减弱）进行实验。与接种野生型菌株相比，接种ΔVdEPG1菌株的棉花植株，其GhSTH-2和GhTXNDC9的表达量均显著下调。同时，接种ΔVdEPG1的植株活性氧积累显著减少，H₂O₂含量降低，活性氧相关基因表达下调。沉默GhSTH-2的植株接种ΔVdEPG1后，同样表现出更严重的病害症状和更高的真菌生物量，但其活性氧爆发仍弱于对照。这些结果说明VdEPG1效应子在调控GhSTH-2和GhTXNDC9表达及相关的活性氧信号中扮演重要角色。

2.7 过表达GhSTH-2增强拟南芥抗性，ΔVdEPG1侵染减弱活性氧响应

在拟南芥中过表达GhSTH-2显著增强了对大丽轮枝菌（无论是野生型还是ΔVdEPG1菌株）的抗性，表现为病害症状减轻、病害指数和真菌生物量降低。过表达植株在接种后表现出更强的活性氧积累和更高的H₂O₂含量，同时活性氧相关基因和防御相关基因的表达也更高。值得注意的是，无论是棉花还是拟南芥，接种ΔVdEPG1菌株的植株活性氧沉积均比接种野生型菌株的植株弱得多，进一步表明VdEPG1在激发宿主活性氧反应中的关键作用。

2.8 效应子VdEPG1抑制GhSTH-2诱导的程序性细胞死亡

将纯化的重组GhSTH-2蛋白渗入本氏烟草叶片，可诱导明显的程序性细胞死亡（PCD）和H₂O₂积累。而当GhSTH-2与VdEPG1蛋白共渗入时，GhSTH-2诱导的PCD和H₂O₂积累被显著抑制，VdEPG1单独处理则不引起任何症状。这直接证明VdEPG1能够抑制GhSTH-2触发的免疫反应。

3. 讨论

本研究鉴定并深入解析了棉花PR10/Bet v1-like蛋白家族成员GhSTH-2在抗黄萎病中的功能与机制。研究发现，GhSTH-2是一个定位于细胞膜和细胞核的抗病正调控因子。其功能发挥依赖于一个精密的分子互作网络：一方面，GhSTH-2与宿主氧化还原蛋白GhTXNDC9互作，推测通过调节氧化还原状态，正调控RBOHs介导的活性氧爆发，从而激活下游防御基因表达和木质素沉积等免疫反应。另一方面，GhSTH-2直接“捕捉”病原菌分泌的毒性效应子VdEPG1。这种互作具有双重意义：其一，它可能是植物识别病原体、启动免疫的机制之一；其二，更为关键的是，VdEPG1通过此互作，反向抑制了GhSTH-2诱导的活性氧积累和程序性细胞死亡，从而实现了对宿主免疫的压制，促进病原菌的侵染和定殖。

研究还发现，接种缺失VdEPG1的突变菌株，宿主中GhSTH-2和GhTXNDC9的表达以及整体的活性氧响应均被削弱，这揭示了效应子VdEPG1本身在“激发”宿主免疫反应（可能是通过被识别）中的非典型作用，体现了植物与病原体在长期协同进化中形成的复杂攻防关系。

综上所述，本研究描绘了一个由GhSTH-2、GhTXNDC9和VdEPG1构成的分子模块，该模块整合了宿主氧化还原信号和病原效应子识别，精细调控活性氧介导的免疫通路，决定了棉花对大丽轮枝菌的抗感染结局。这项工作不仅增进了对植物-病原体分子互作机制的理解，而且为通过分子育种或基因工程靶向GhSTH-2相关通路，培育持久抗黄萎病棉花品种提供了重要的理论依据和基因资源。