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本文通过计算机模拟（DMD/PRIME20）深入研究了帕金森病相关蛋白α-突触核蛋白（αSyn）N端区域两个关键基序P1和P2的自组装行为，揭示了它们形成平行β-折叠和β-发夹的固有倾向。研究特别阐明了抑制性突变L38M通过减少平行β-折叠和β-发夹的形成，从而阻碍全长αSyn在体外和体内聚集的分子机制，为理解αSyn纤维化的起始调控及潜在治疗策略提供了结构层面的新见解。
引言
α-突触核蛋白（α-synuclein, αSyn）是一种与多种神经退行性疾病（统称为突触核蛋白病）相关的突触前蛋白，包括帕金森病、路易体痴呆和多系统萎缩。αSyn的淀粉样纤维是路易体和路易神经突的主要成分。全长αSyn（αSyn-FL）包含三个区域：N端结构域（αSyn [1–60]）、中央疏水的非淀粉样组分（Non-Amyloid Component, NAC）区（αSyn [61–95]）和C端结构域（αSyn [96–140]）。虽然NAC区构成了所有已知αSyn纤维的核心，但越来越多的证据表明，侧翼区域，特别是N端，在启动或调控淀粉样纤维形成中扮演着关键角色。
其中，N端区域的两个基序——P1（αSyn [36–42]）和P2（αSyn [45–57]）——被证实是调控αSyn-FL纤维化的关键。删除这些区域或对P1区进行单点突变（如L38M）能够抑制全长蛋白的淀粉样形成。然而，这些基序在分子层面如何驱动或抑制聚集的机制尚不清楚。
野生型αSyn片段在模拟中组装成纤维样结构
本研究使用粗粒度分子动力学模拟包DMD/PRIME20，模拟了P1、P2、以及包含两者的更长片段P3（αSyn [36–57]）和P3Next（αSyn [27–57]）的自组装过程。模拟在特定温度和浓度下进行，所有野生型片段在模拟中均自发组装成富含β-折叠的纤维样结构，但内部组织形式各异。
P1-WT（野生型）显示出形成平行β-折叠层，并以反平行方式堆叠成多层纤维的倾向。平均90%的残基采用了平行β-链构象，反平行链随机出现。P2片段则形成单层平行β-折叠，并弯曲成U形或S形纤维，这与实验观察到的PreNAC片段（αSyn [47–56]）形成纳米晶体结构的结果一致，其弯曲源于序列中心的甘氨酸（Gly51）和疏水核心的形成。
P3-WT（包含P1、P2及其连接残基）形成了单层β-折叠，其中平行和反平行链的比例在不同模拟中存在差异，表明P3-WT可以采取多种聚集途径，这与αSyn-FL寡聚体表现出的多态性行为一致。作为对照，被预测为低淀粉样倾向的C1ext片段在所有模拟中均未发生聚集，验证了模拟方法的特异性。
P3Next-WT（向N端延伸的更长片段）在所有模拟中均产生了含有β-发夹基序的β-折叠纤维。β-发夹的数量在模拟间存在差异，平均占单个纤维中总β-链的23%。这些模拟结果与先前研究一致，表明P1/P2区域形成的β-发夹可作为分子间结合元件，促进平行寡聚体的形成，是启动αSyn-FL自组装的重要步骤。
单点突变L38A、V40A和L38M对片段自组装的影响
实验表明，L38A和V40A突变对αSyn-FL的淀粉样形成动力学没有影响，而L38M突变则能抑制全长蛋白的淀粉样组装。为了在分子层面理解这些差异，研究模拟了这些突变在P1、P3和P3Next片段中的效应。
所有P1变体（WT、L38A、V40A、L38M）都形成了多层纤维，但形态和β-链排列不同。P1-L38A形成棱柱状纤维，反平行含量极低（2%）；P1-V40A形成规则的两层纤维，反平行含量与WT相似（10%）；而P1-L38M纤维中平行链较少，反平行残基比例显著更高（35%）。这表明L38M突变独特地促进了反平行排列。
在P3片段中，L38M仍能形成类似于WT的混合平行/反平行单层纤维。然而，L38A在多数模拟中未能聚集，V40A的结果则不确定（部分聚集，部分为无规卷曲）。这与它们在全长蛋白中的无影响表型不同，提示片段长度影响了突变效应。
为了更贴近生理环境，研究考察了更长的P3Next片段。结果显示，尽管所有P3Next变体都形成了纤维，但L38M突变显著降低了纤维中β-发夹的形成比例（平均16%），低于野生型（23%）。相比之下，P3Next-L38A和P3Next-V40A的β-发夹含量甚至高于野生型。统计分析和样本量评估支持这一结论的可靠性。对未能聚集的L38A和V40A系统进行升温退火处理或降低模拟温度后，部分系统发生了聚集，表明其非聚集行为是动力学陷阱和热力学稳定性改变共同作用的结果。
研究还模拟了另外两个突变Y39A和S42A，它们被报道会增加αSyn纤维化的延迟期并导致寡聚体陷落。在P1中，两者都表现出高于WT的反平行β-链含量，但低于L38M。在P3Next中，Y39A（位于β-发夹转角）反而增强了β-发夹形成，S42A（位于β-链上）则影响不大，这突显了突变位置在调控β-发夹结构和聚集行为中的重要性。
讨论与结论：L38M抑制αSyn纤维化的可能机制
基于模拟结果和已有的αSyn聚集机制模型，本研究提出了L38M突变抑制αSyn-FL淀粉样形成的两种可能通路。
首先，L38M可能通过减少P1/P2区域中β-发夹的形成来抑制聚集。β-发夹被认为在寡聚化早期作为分子间结合位点至关重要。模拟发现，在P3Next-L38M形成的β-发夹中，第38位残基（甲硫氨酸）通常位于较长的（4个残基）环区内，而其他变体（WT、L38A、V40A）的第38位残基多位于环的起始点或仍属于β-链，且环长通常更短（3个残基）。更长的环长和甲硫氨酸侧链的体积可能使发夹结构稳定性降低，从而减少其形成，阻碍了启动纤维化所必需的寡聚体构象的建立。
其次，L38M可能通过增加反平行寡聚体的形成来抑制纤维化。模拟显示P1-L38M有更高的反平行β-链比例。大量实验研究表明，反平行寡聚体通常与“偏离路径”的、不能生长为成熟纤维的预纤维物种相关。因此，L38M可能通过稳定无生产力的反平行寡聚体，或者迫使系统经历从反平行到平行的重排（这一过程速度较慢），从而延缓或阻止淀粉样纤维的形成。
总之，本研究通过计算机模拟阐明，αSyn N端的P1和P2基序具有形成平行β-折叠和β-发夹的高倾向性，这些结构是驱动纤维化的关键。抑制性突变L38M并非降低序列本身的聚集倾向，而是通过改变其在聚集早期形成这些“促纤维化”结构的能力来发挥作用，具体表现为减少平行β-折叠和β-发夹的形成，同时可能促进反平行结构的生成。这为理解αSyn聚集的分子起源和设计针对此区域的新型抑制剂提供了重要的结构见解。
