1 引言
长久以来，富含β-折叠的淀粉样蛋白纤维被认为是导致许多蛋白质错误折叠疾病中细胞死亡的关键物种。然而，大量证据已改变了这一认知。目前普遍认为，在纤维形成之前出现的、瞬时的寡聚体中间物，才是驱动细胞功能障碍和死亡的主要元凶。这些寡聚体由诸如Aβ、tau、α-突触核蛋白、胰淀素、转甲状腺素蛋白和TDP-43等淀粉样蛋白形成，广泛存在于多种神经退行性和系统性疾病中。
然而，对寡聚体分子特性的理解仍很粗浅，这主要归咎于其天然的低丰度、结构异质性和动力学不稳定性。标准生物物理和生化方法的数据采集速度往往慢于寡聚体的生命周期，导致数据是对其演化过程中多种中间体的平均。此外，许多实验所需的高蛋白浓度可能人为加速聚集，产生在生理相关条件下不存在的物种。单一蛋白质还能形成具有不同结构和毒性的独特寡聚体“株系”。因此，实验条件高度影响着寡聚体物种的类型和性质，缺乏细胞复杂环境的体外制备可能无法复制疾病相关的构象体。
2 尺寸与结构确定方法
2.1 生物化学与生物物理方法的能力与局限
检测错误折叠寡聚体常依赖于其β-折叠含量的增加，通常使用硫黄素T（ThT）和刚果红等染料测量。但这些检测是非特异性的，需要圆二色性（CD）或傅里叶变换红外光谱（FT-IR）等光谱方法确认。关键的是，某些毒性寡聚体（如TDP-43寡聚体）可能采用非β-折叠结构，从而被常规探针漏检。
淀粉样蛋白寡聚体的毒性常与表面疏水性增加有关，这促进了与细胞膜的非特异性相互作用。表面疏水性常用8-苯氨基-1-萘磺酸（ANS）等染料探测。CD、FT-IR和拉曼光谱是研究寡聚体二级结构和监测原纤维形成过程中构象变化的最常用技术。它们揭示了淀粉样蛋白寡聚体由β-折叠、α-螺旋和无序区域组成。然而，CD和FT-IR使用体外制备的寡聚体样品，可能无法准确反映在拥挤的细胞环境中形成的寡聚体结构，并且两者都产生整体平均测量，从而掩盖了动态寡聚体群体内的异质性。
小角X射线散射（SAXS）是一种溶液技术，可提供低分辨率结构信息。它对样品多分散性和异质性高度敏感，因此常与尺寸排阻色谱联用。高速原子力显微镜能独特地捕获寡聚体物种和膜相互作用的瞬时动态，这是CD和FT-IR等整体平均技术无法获取的信息。质谱可提供寡聚体尺寸、化学计量和结构信息，并能唯一地识别翻译后修饰。
总之，表征寡聚体需要多模态方法，因为没有单一技术能提供完整信息。
2.2 淀粉样蛋白寡聚体的核磁共振研究
2.2.1 溶液核磁共振波谱
溶液态核磁共振在淀粉样蛋白研究中占据关键位置：它能表征寡聚体的瞬时性和柔性特性，这是许多高分辨率技术无法企及的。它特别适用于在近生理条件下研究如Aβ和α-突触核蛋白等固有无序蛋白的早期寡聚化。对于高达约100 kDa的系统，多维核磁共振可通过弛豫测量提供原子水平的二级结构和主链动力学洞察。
用于定位聚集倾向区域的常见核磁共振实验包括化学位移扰动分析、氢/氘交换实验和顺磁弛豫增强。扩散排序光谱可获得流体动力学半径和实时寡聚化数据。流变-核磁共振监测施加机械应力时蛋白质的结构和动态变化。另一种方法，氟-19核磁共振，依靠氟标记，可提供位点特异性、无背景的信号。暗态交换饱和转移等弛豫方法可以量化与低丰度或“暗”态和原纤维接触的交换。
核磁共振方法对于理解Aβ聚集至关重要。弛豫和暗态交换饱和转移核磁共振技术解析了可溶态和原纤维态之间的瞬时交换过程。甲基分辨方法定位了聚集倾向核心和侧链动力学。溶液核磁共振还研究了小分子如何通过改变聚集途径或与寡聚体形成表面相互作用来调节Aβ聚集。
除Aβ外，溶液核磁共振也成功应用于研究其他蛋白质的聚集。对于α-突触核蛋白，溶液核磁共振揭示了疾病相关突变体的膜结合构象、单体-纤维结合、次级成核机制和脂质共组装动力学。tau蛋白的凝聚和聚集已被证明依赖于翻译后修饰和涉及FKBP51和p23的共伴侣网络。类似地，溶液核磁共振被用于研究亨廷顿蛋白外显子-1聚集的瞬时寡聚体物种及其与伴侣的相互作用。
2.2.2 固态核磁共振波谱
固态核磁共振波谱被广泛用于研究淀粉样蛋白寡聚体的结构、动力学和组装。虽然溶液核磁共振通常适用于研究小尺寸寡聚体和单体，但固态核磁共振技术则用于研究大尺寸寡聚体、原纤维和成熟纤维。
利用魔角旋转来平均各向异性相互作用，结合同位素标记，固态核磁共振允许分配13C和15N化学位移，从而提供二级结构信息。分子间距离可通过重耦魔角旋转实验探测。这些数据然后被用于建模聚集结构并区分不同的淀粉样蛋白多晶型。
固态核磁共振为异质聚集体提供位点特异性和残基水平的分辨率。对Aβ寡聚体的研究揭示了错位平行和反平行β-折叠、由翻译后修饰引起的构象变化以及金属离子的影响。固态核磁共振研究增进了我们对“途中”和“脱途”寡聚体的理解以及膜破坏机制的理解。固态核磁共振还为tau、α-突触核蛋白、人胰淀素、转甲状腺素蛋白和朊病毒蛋白寡聚体提供了结构细节。
尽管有其优势，固态核磁共振在技术上可能要求很高，需要大量同位素标记的样品。高度异质和多晶型的样品也会限制灵敏度和光谱分辨率。然而，其中一些挑战可以通过结合快速魔角旋转、非均匀采样、质子检测和动态核极化方法来克服。
2.2.3 用于研究蛋白质错误折叠和聚集动力学的细胞内核磁共振
细胞内核磁共振波谱学已被开发出来，用于直接在活细胞中观察蛋白质，并深入了解动态翻译后修饰和降解途径。一个关键应用是研究如α-突触核蛋白等固有无序蛋白。时间分辨的细胞内核磁共振进一步显示，α-突触核蛋白在体外和体内都经历了受调节的蛋白水解加工。
细胞内核磁共振也被证明对于研究SOD1的聚集有价值。随后的工作表明，铜伴侣CCS可以在人细胞中挽救这些突变体的折叠。在递送、标记和方法方面的进展，如动态核极化增强核磁共振，现在允许在近内源浓度下跟踪人细胞中蛋白质的成熟和折叠。
2.3 淀粉样样寡聚体的X射线晶体学
X射线衍射为淀粉样蛋白寡聚体提供了高分辨率的洞察，揭示了与毒性相关的、不同于成熟纤维的结构基序。例子包括“圆柱蛋白”寡聚体，以及由Aβ衍生肽组装成的基于β-发夹的三聚体。虽然X射线衍射提供原子分辨率数据，但结晶需要稳定、均质的样品。因此，X射线衍射结构通常只反映最有序的物种，代表了溶液和活细胞中存在的动态寡聚体群体中的有限子集。
2.4 冷冻电子显微镜
冷冻电子显微镜在获得寡聚体物种的高分辨率结构洞察方面有很大潜力。然而，由于寡聚体通常较小、异质且瞬时，单颗粒冷冻电镜研究受到信噪比低和由于结构可变性导致的颗粒对齐困难的限制。为了克服由于寡聚体浓度低和样品异质性带来的限制，已经开发了一种基于抗体的方法，在玻璃化之前直接将寡聚体固定在抗体功能化的格栅上。
2.5 电子顺磁共振波谱学
电子顺磁共振波谱学长期以来一直被用于表征在溶液和膜模拟环境中形成的淀粉样蛋白纤维。最近，由于其高灵敏度和提供位点特异性动力学和距离约束的能力，电子顺磁共振已被应用于研究短寿命和异质的淀粉样蛋白寡聚体。在注意事项中，电子顺磁共振需要将蛋白质标记上顺磁自旋标记，这可能会改变聚集过程。
2.6 结合生物物理和成像方法的细胞内研究
有潜力在细胞内提供寡聚体结构和功能信息的有前途的技术是超分辨率荧光成像技术。应用这些技术使得在细胞模型中观察瞬时物种并推断其毒性功能成为可能，其中寡聚体用荧光染料或构象特异性抗体检测。然而，荧光探针可能会干扰寡聚体结构或动力学，并且成像伪影可能使数据解释复杂化。
F?rster共振能量转移是另一种可用于实时监测寡聚体形成和群体动力学的活细胞荧光方法。然而，其局限性在于对距离和荧光团相对偶极取向的高度敏感性，这可能给距离测量带来模糊性。
光诱导未修饰蛋白质交联是一种用于在细胞环境中研究寡聚体的相对简单的检测方法。其关键优势是能够通过交联快速稳定瞬时寡聚体物种，而无需荧光标记或蛋白质修饰。当与SDS-PAGE、质谱或蛋白质印迹结合使用时，可用于确定细胞培养物或动物组织来源样品中的寡聚体尺寸和错误折叠蛋白质的身份。然而，目标蛋白质与其他细胞蛋白质之间的非特异性交联可能产生伪影并使寡聚体尺寸的解释复杂化。
冷冻电镜与荧光显微镜的结合已成为研究寡聚体的有力方法。例如，冷冻相关光和电子显微镜及冷冻电子断层扫描被用于可视化从肌萎缩侧索硬化症患者衍生的神经元亚细胞区室内TDP-43的错误定位和聚集。这些例子表明，冷冻电镜与荧光方法以及细胞或体内疾病模型的结合可以在原位捕获寡聚体结构并了解其毒性功能。
2.7 分子动力学模拟揭示淀粉样蛋白寡聚体的瞬时结构和毒性相互作用
分子动力学模拟是一种计算机模拟技术，可以提供对短寿命寡聚体物种异质构象变化的洞察，这些细节通常是实验方法无法企及的。分子动力学模拟的应用涵盖了寡聚体组装的早期阶段、寡聚体与脂膜、金属离子和分子伴侣的相互作用、翻译后修饰对寡聚体稳定性的影响以及膜中孔的形成和配体结合。然而，其预测能力主要受其力场精度和模拟时间尺度有限的约束。此外，这种计算机模拟方法的发现需要实验验证。
3 在复杂生物环境中检测错误折叠蛋白质
对死后人体和体内模型组织的分析提供了关于致病性聚集后期阶段的信息，这些组织中的寡聚体通常用构象特异性免疫组织化学、免疫金电镜和斑点印迹检测。
酶联免疫吸附测定是复杂生物流体中蛋白质定量的标准方法，但由于表位掩蔽，该方法对寡聚体的灵敏度低。为了克服这些限制，已经开发了时间分辨免疫荧光测定来优化抗体之间的间距。为了最大限度地减少单体干扰，多聚体检测系统将结合所有蛋白质物种的捕获抗体与针对寡聚体表位的检测抗体配对。
基于流式细胞术的方法为分析复杂的生物样品提供了另一种选择，可以通过大小和抗体标记来区分血浆中的寡聚体颗粒。尽管如此，基于抗体的技术的一个限制是抗体与无关蛋白质之间的交叉反应性。
邻近连接测定已被应用于直接、原位检测组织标本中的寡聚体。该方法的信号可能因表位掩蔽而减弱，并且信号严重依赖于表位接近度、密度、可及性和扩增，而不仅仅是寡聚化。因此，通常用酶联免疫吸附测定、免疫金电镜和质谱来补充，以确认寡聚体身份。
脑脊液和血浆中淀粉样蛋白及其寡聚体水平升高是阿尔茨海默病和帕金森病明确的生物标志物。种子扩增检测，如实时震动诱导转化，可以通过利用朊病毒寡聚体模板重组底物聚集的能力，以高灵敏度检测脑脊液中这些错误折叠寡聚体的飞摩尔到阿托摩尔浓度。这些检测可以区分脑脊液中的α-突触核蛋白、tau和朊病毒种子。尽管区分株系存在普遍挑战，但该技术已成功应用于区分与不同突触核蛋白病相关的α-突触核蛋白株系，表明其可用于病理亚型分型的潜力。
4 细胞模型
4.1 永生化细胞系中的毒性研究
寡聚体诱导毒性的研究使用了一系列细胞模型，从用于高通量筛选的永生化细胞系到更复杂的患者来源的诱导多能干细胞。其中，MTT和乳酸脱氢酶是用于初步筛选代谢活性和细胞毒性的标准检测方法。然而，这些检测的结果需要仔细解读。因此，使用单一检测来检测毒性是不够的，初步毒性筛选必须采用一组检测方法来探查不同的细胞通路。
4.2 外源性寡聚体应用
尽管许多淀粉样蛋白，如α-突触核蛋白和tau，通常是细胞内的，但外部应用其预形成的寡聚体对于研究其毒性具有重要作用。将寡聚体外源性应用于永生化细胞系，已经阐明了多种毒性机制。在永生化细胞中的许多发现也在更复杂的神经元和体内模型中得到了重复。
基于F?rster共振能量转移的生物传感器细胞系是广泛使用的检测方法之一，用于研究寡聚体摄取和错误折叠物种的细胞内传播。由于标签可能干扰寡聚体形成，生物传感器细胞开发的重点一直放在使用较小的荧光团作为标签，并进行严格的比较研究，以确认标记不会人为改变寡聚体特性。
寡聚体毒性的病理相关性与其前体蛋白质的天然亚细胞定位内在相关。因此，使用功能依赖于位置的蛋白质进行外部应用本身是有限的，并可能导致与体内形成的聚集体不同的毒性效应。
虽然寡聚体的外源性应用提供了精确的剂量和时间控制，但该方法面临局限性。重组制备可能无法重现人类疾病中存在的结构异质性，并且组织来源的寡聚体可能被苛刻的提取方案改变。此外，由于寡聚体是瞬时和不稳定的，实验条件会改变其结构和动力学，使数据解释复杂化。因此，这些发现需要进一步验证。
4.3 过表达系统
永生化细胞和神经元细胞中的过表达系统由于方便和可重复性，一直是研究蛋白质错误折叠的流行方法。然而，它们的非生理性蛋白质水平可能产生伪影。过表达的替代方法是用CRISPR/Cas9标记内源蛋白质，并在自然条件下用单分子荧光成像监测其寡聚体形成。一个关键的考虑是，即使是很小的标签也会影响聚集动力学，并可能使解释产生偏差。
4.4 原代神经元培养和患者来源的诱导多能干细胞神经元
虽然分化细胞提高了它们研究某些蛋白质聚集的相关性，但这些模型仍然受到内在不稳定性的限制。因此，原代啮齿动物海马神经元已成为更受青睐的、具有更大生理相关性的细胞模型。例如，使用这些培养物的研究表明，Aβ寡聚体会急性破坏突触功能，导致钙调节异常、氧化应激、突触丧失和细胞凋亡。
患者来源的诱导多能干细胞神经元的使用有所增加，因为它们提供了一个遗传匹配的系统来研究疾病机制。例如，关于α-突触核蛋白毒性的关键见解，如分子伴侣介导的自噬缺陷和内质网应激，是使用诱导多能干细胞神经元获得的。该细胞模型的主要限制是供体间的变异性，这可能混淆疾病相关表型的解释。因此，应尽可能使用来自多位患者的细胞系，并结合同基因对照来分离基因型特异性效应与背景变异。此外，缺乏天然组织环境，可以放大寡聚体毒性并改变其行为，因此需要在类器官或动物模型中进行进一步验证。
4.5 用于组织相关环境的3D类器官培养
3D类器官培养重现了大脑结构的许多方面。一个显著的进展是开发了一种血管化的神经免疫类器官，当暴露于散发性阿尔茨海默病患者的脑提取物时，在4周内积累了Aβ和tau样包涵体，表现出突触丧失和神经炎症，从而密切模拟了人体组织病理学。然而，厚组织中的扩散限制导致长时间培养期间的营养/氧气剥夺和中央坏死。因此，将类器官维持超过约2-3个月以模拟衰老是困难的，限制了对晚发性疾病的研究。实现正确的神经元和胶质细胞混合以促进血管化和可靠生长仍然具有挑战性，并且每批新类器官都需要验证，使得这些培养物的生长耗时且耗费资源。此外，重现髓鞘形成和功能性血脑屏障以及成熟的细胞外基质仍处于开发阶段。总之，成功维持类器官培养需要一致的细胞分化，最大限度地减少中央坏死，并纳入缺失的细胞类型。然而，它们的优势在于能够模拟疾病病理学并捕获体内般的复杂性。
5 结论与未来展望
本文综述了常用于研究淀粉样蛋白寡聚体及其在细胞中致病作用的技术。具体而言，本综述讨论的实验策略旨在解决三个关键的寡聚体特性：结构多态性、瞬时性和生物学相关性，并解决以下问题：存在哪些物种以及分布如何？寡聚体的结构特征是什么？寡聚体如何形成和相互转换？它们在细胞中的定位和分布如何？哪些物种与毒性表型最密切相关？
显然，没有任何单一方法足以完全表征寡聚体。为了在机制上建立寡聚体结构与毒性之间的可靠联系，必须采用多学科方法，整合来自互补技术的数据。未来，将冷冻电子显微镜、固态核磁共振和质谱等先进结构与生物物理工具，与反映疾病环境的复杂细胞和体内模型（如患者来源的诱导多能干细胞、类器官和转基因动物）相结合，对于增进我们对寡聚体致病机制的理解至关重要。最终，这些见解将为开发针对蛋白质聚集疾病的有效治疗策略铺平道路。
