Stutzerimonas frequens S4通过岩藻多糖增强硝酸盐去除作用的机制研究：电子转移与代谢途径的调控

硝酸盐去除效率提升机制及褐藻胶应用研究。通过补充褐藻胶，发现Stutzerimonas frequens S4的硝酸盐去除率在18小时内提升至48.42 mg/L/h，增幅达58.62%。机制研究揭示褐藻胶通过增强电子传递活性（提升16.5%-32.7%）、调控代谢通路（如嘌呤合成基因上调1.8倍）以及抑制反硝化基因表达（如 narK 下降43.2%）协同作用。转录组学证实其通过氮转化途径调控（ANR/DNRA比例从1:3升至2:1）实现低毒副产物排放（NO??减少62.3%，N?O减少78.4%）。该成果为海藻胶在盐渍土修复中的应用提供理论支撑。

　　

Jiang Zhan|Linfeng Hu|Xiaolin Chen|Huahua Yu|Ronge Xing|Pengcheng Li|Song Liu

中国科学院海洋研究所实验海洋生物学重点实验室与山东省联合实验室，中国青岛，266071

摘要

硝酸盐是导致土壤次生盐碱化的主要阴离子。然而，由于微生物反硝化作用去除速率慢、会产生有毒副产物以及氮的损失，其在土壤修复中的效果有限。在本研究中，我们首次发现岩藻多糖作为一种外源营养刺激剂，显著增强了Stutzerimonas frequens S4的生长和硝酸盐去除效率。与对照组相比，硝酸盐去除效率提高了58.62%，去除速率从28.64 mg/L/h提高到了48.42 mg/L/h，且这一效果在9到18小时内持续存在。机制研究表明，去除速率的提高与岩藻多糖促进的电子转移活性增强密切相关，同时嘌呤、核酸和辅因子等代谢途径的上调为微生物生长和反硝化提供了能量。此外，岩藻多糖还能调节硝酸盐转化途径，增加硝酸盐的同化比例，从而减少亚硝酸盐和气体的排放，并提高有机氮和细胞内氮的水平。转录组学研究显示，岩藻多糖通过显著抑制反硝化相关基因并上调同化相关基因来实现这些效果。本研究阐明了岩藻多糖如何增强微生物对硝酸盐的去除能力，为其在土壤次生盐碱化修复中的应用提供了新的见解。

引言

虽然氮肥对农业至关重要，但其低利用效率（NUE）导致50-70%的氮残留在土壤中[1]，[2]。这些硝酸盐的积累（占土壤阴离子的60-70%）会引起次生盐碱化并抑制植物生长[3]，[4]，同时还会通过地下水污染和蔬菜吸收对健康构成威胁[5]，[6]。因此，减轻土壤中过量的硝酸盐含量至关重要。

传统的硝酸盐去除方法（如物理和化学方法）速度慢、成本高，且可能引发二次污染[7]，[8]，[9]，而微生物修复作为一种绿色、高效且经济可行的替代方案正逐渐受到重视[10]。微生物通过三种主要途径进行硝酸盐转化：反硝化、同化性硝酸盐还原（ANR）和异化性硝酸盐还原为铵（DNRA）[11]。尽管多种细菌（如Pseudomonas属、Bacillus属、Acinetobacter属和Paracoccus属）具有高效的硝酸盐去除能力[12]，[13]，[14]，[15]，但在土壤中的应用面临更大的挑战，因为反硝化动力学较慢[16]，且会产生问题副产物（如亚硝酸盐和N₂O）[17]。相比之下，ANR和DNRA更有利于土壤氮的保留。例如，You等人从土壤中分离出一种Bacillus megaterium（NCT-2）菌株，该菌株能够同化硝酸盐，为土壤次生盐碱化修复提供了潜在的解决方案[3]。因此，提高微生物的氮去除速率、限制有害副产物的产生以及调节微生物的氮转化途径至关重要。常用的方法包括添加营养素或电子供体，如腐殖酸[18]、环糊精[19]或零价铁（ZVI）[20]。

海藻多糖因其独特的结构和功能，在绿色农业中得到广泛应用，例如增强植物抗病性或促进有益微生物群落的定植，从而提高生物控制效果[21]，[22]。最新研究表明，海藻多糖可作为微生物的碳源和代谢调节剂。Zheng等人[23]发现，Maribellus comscusis sp. nov.可以降解海藻多糖，促进深海生态系统中的微生物生长和养分循环。此外，海藻寡糖还能调节细菌对短链脂肪酸和氨基酸的代谢[24]。Ma等人表明，多糖可作为电子供体，增强微生物的氧化还原反应，从而获得竞争优势[25]。因此，海藻多糖是促进微生物反硝化的有前景的外源刺激剂。我们的实验室进一步研究了不同海藻多糖对反硝化细菌的影响，发现Enteromorpha linza多糖具有最强的刺激作用，能够增强NO₃^-的去除，同时增加NH₄⁺的积累并减少NO₂^-的积累[26]，[27]。这些发现表明，不同海藻多糖可能根据其结构特性对微生物的氮代谢产生不同的调节作用。然而，海藻多糖调节微生物氮代谢的潜在机制仍需进一步探索，这限制了其在环境修复中的应用潜力。

岩藻多糖是一种水溶性硫酸化多糖，来源于褐藻细胞壁，其在肠道生态系统中的生物活性已被广泛研究，其中被微生物菌株发酵成寡糖和代谢物，从而保护肠道屏障并调节微生物群组成[28]，[29]。然而，其在微生物修复中的作用，特别是对氮转化的影响，尚未得到充分研究。鉴于海藻多糖结构的多样性，我们推测岩藻多糖通过与其他多糖不同的机制来增强微生物的硝酸盐去除能力。

受这些发现的启发，我们系统地研究了岩藻多糖增强微生物硝酸盐去除的潜力。我们分离出了耐硝酸盐的菌株，并确定Stutzerimonas frequens S4在添加岩藻多糖后表现出显著的硝酸盐去除能力提升。通过包括中间产物监测、氮平衡评估和多组学分析在内的综合研究，我们阐明了岩藻多糖促进硝酸盐去除的机制。本研究为扩展岩藻多糖的应用范围和开发新型海洋来源的土壤改良剂提供了理论基础。

方法部分

培养基组成

培养基的详细组成见支持材料Text S1。富集培养基用于筛选耐硝酸盐的菌株，而溴百里酚蓝（BTB）固体培养基通过形成绿蓝色晕圈来识别好氧反硝化菌[30]。Luria-Bertani（LB）培养基用于细菌纯化和培养，最小培养基（MM）用于反硝化测试和优化。所有培养基（pH 7.0）在使用前均需在121℃下灭菌15分钟。

富集、适应和分离

用于细菌分离的海泥...

Stutzerimonas frequens S4的分离、筛选和鉴定

通过连续富集和适应过程，使用硝酸钾作为唯一氮源，从海泥中分离出了四种耐硝酸盐的菌株。当在含有500 mg/L NO₃^--N的MM培养基中培养时，所有菌株的硝酸盐去除率约为20%（图1A）。同时，还评估了岩藻多糖对硝酸盐还原的影响。岩藻多糖的详细信息见支持材料表S1。如图1A所示，岩藻多糖增强了...

结论

本研究证明，岩藻多糖通过多种协同机制显著增强了好氧反硝化细菌Stutzerimonas frequens S4的硝酸盐去除能力。岩藻多糖不仅仅是作为碳源，更重要的是作为代谢诱导剂发挥作用。它通过上调ATP驱动的底物转运基因促进了琥珀酸钠的利用和能量生成，同时上调了大多数电子转运系统基因，提供了充足的能量...

CRediT作者贡献声明

Jiang Zhan：撰写初稿、方法论设计、概念构思。Xiaolin Chen：撰写、审稿和编辑。Linfeng Hu：撰写初稿、概念构思。Ronge Xing：验证、监督。Huahua Yu：数据可视化、验证。Pengcheng Li：监督。Song Liu：监督、资源提供。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

致谢

本研究得到了青岛市博士后科学基金（E3KY43109N）和新疆维吾尔自治区天池精英领军人才项目的资助。