花粉的荧光寿命成像及其古生态学意义：以Sonneratia为例的研究

《Review of Palaeobotany and Palynology》：Fluorescence lifetime imaging of pollen and its palaeoecological implications: A case study of Sonneratia

本研究利用荧光寿命成像显微术（FLIM）对六种中国热带红树林优势种 Sonneratia 的花粉进行分类分析，发现FLIM数据可有效区分其种间差异（τ3为关键参数），揭示引入种 Sonneratia apetala 与本土种在荧光特性上的显著差异，为古生态重建提供新方法。

　　

吴俊贤|薛景石|陈伟|顾秦然|杨中南|毛立民

中国科学院南京地质古生物研究所古生物学与地层学国家重点实验室，南京210008，中国

摘要

现代花粉形态学为植物分类学、系统学和进化研究提供了重要信息。化石花粉粒在古植物学和古生态学研究中得到了有效应用。然而，使用传统的光学显微镜（LM）难以识别相似类型的花粉粒（例如禾本科植物）。近年来，光谱技术为检测花粉化学成分提供了新的方法，从而提高了分类精度和古生态学意义。在这些技术中，荧光寿命成像显微镜（FLIM）因其高分辨率、非破坏性以及对花粉壁化学成分的敏感性而受到越来越多的关注。

在这项研究中，我们使用FLIM研究了Sonneratia属，包括6个物种（Sonneratia ovata、S. apetala、S. × gulngai、S. alba、S. × hainanensis和S. caseolaris）。结果表明，FLIM数据可以将Sonneratia花粉有效分类为四组：1）Sonneratia apetala；2）S. × hainanensis、S. caseolaris和S. × gulngai；3）S. ovata；4）S. alba。此外，观察到的分类模式有助于初步评估两个杂交类群与其亲本物种之间的系统发育关系。值得注意的是，引入的物种S. apetala与中国本土Sonneratia物种之间存在明显的荧光寿命差异，这可能反映了它们在生物地理历史和生态适应方面的差异。

根据我们对Sonneratia现代花粉的研究，FLIM提供了关于分类学、生物地理学和系统学的宝贵信息。鉴于FLIM从化石花粉中获取的数据可以与现存物种的数据进行比较，这种方法在提高Sonneratia化石花粉的物种水平鉴定方面具有巨大潜力。因此，FLIM为理解热带红树林的古生态学、进化历史和历史特征打开了一扇新窗口。

引言

作为植被和环境变化的重要指标，花粉分析一直被用于植被重建（例如Courtney Mustaphi等人，2025年；Gu等人，2025年；Song等人，2017年）、气候和环境变化的研究，而准确鉴定花粉是花粉分析的基本方面之一（Cohen，2011年；Yi等人，2003a；Yi等人，2003b）。自从von Post首次制作花粉图谱以来（Von Post，1916年），人们一直在努力提高分散花粉粒的分类精度。传统上，花粉鉴定依赖于基于形态学的现代花粉采集（Jones和Bryant，2007年）。自动化花粉分类工具的发展已成为必然趋势（Li等人，2024年；Zhang等人，2024年；Zhang和Mao，2025年）。然而，对于形态学差异较小的分类单元，传统方法往往不够有效。在过去十年中，包括傅里叶变换红外光谱（FTIR）、拉曼光谱和荧光寿命成像显微镜（FLIM）在内的光谱技术越来越多地应用于花粉研究，因为它们提供了超出形态学的详细化学和结构信息（Baskin等人，2014年；Coles等人，2015年；Diehn等人，2020a；Diehn等人，2020b；Hu等人，2023年；Ivleva等人，2004年；Jardine等人，2019年；Jardine等人，2021年；Julier等人，2016年；Schulte等人，2008年；Seifert等人，2015年；Zimmermann，2010年）。这些方法为更全面地表征花粉和提高基于形态学的方法的鉴定精度提供了新的可能性。

尽管关于孢粉素（sporopollenin）的组成和结构存在争议（Brooks和Shaw，1978年；Chen等人，2024年；Crang和May，1974年；Kawase和Takahashi，1995年；Li等人，2019年；Schulze Osthoff和Wiermann，1987年；Xue等人，2020年；Zetzsche和B?hler，1931年），但其显著的稳定性使其在光谱方法中得到广泛应用（Chen等人，2025年；Sun等人，2021年）。花粉分类以前是通过检查孢粉素的紫外吸收光谱和内在自荧光来完成的（Southworth，1969年；Willemse，1972年）。随着仪器精度和性能的提高，对化学性质相似且形态学上无法区分的花粉（例如禾本科植物）有了更深入的了解（Diehn等人，2020a；Jardine等人，2019年；Zimmermann，2010年）。FTIR和拉曼光谱的结合为花粉特征的详细分析提供了定量分析框架（Ken?el和Zimmermann，2020年）。后续研究表明，比较化石和现存花粉有助于古生态学重建（例如Jardine等人，2021年）。孢粉素的UV-B响应性使得花粉的光谱特征能够反映地质历史中的重要事件（Benca等人，2018年；Liu等人，2023年；Lomax等人，2012年；Seddon等人，2021年；Seddon等人，2020年）。因此，光谱技术提供了比传统光学方法更丰富和全面的数据集，不仅为机器学习应用奠定了基础，也为古生态学重建提供了重要证据。

基于荧光的分析使用激光共聚焦显微镜具有显著优势：它们高效、非破坏性，并能同时捕获形态学和光谱信息，从而便于花粉鉴定（Bastiaens和Squire，1999年；Wang和Dobritsa，2021年；Wilson，2023年）。早期的荧光研究主要集中在气溶胶和自荧光植物组织上（Mitsumoto等人，2009年；O'Connor等人，2011年；P?hlker等人，2013年；P?hlker等人，2012年；Roshchina，2003年；Roshchina和Mel'nikova，2001年）。此后，荧光光谱的解释取得了显著进展。先前的研究表明，种子植物、蕨类和苔藓植物表现出不同的内部生化组成，这可以通过荧光光谱特征揭示出来（Jia等人，2025年；Xue等人，2020年）。此外，不同环境中的花粉之间的荧光强度差异反映了不同的UV-B响应（Jia等人，2025年）。在这些技术中，荧光寿命成像显微镜（FLIM）提供了高精度、化学信息丰富的数据，准确反映了孢粉素的组成差异（Hu等人，2023年）。这一优势突显了FLIM的方法学潜力，不仅提高了物种水平的分类精度，还有助于生态学和古生态学分析。

为了进一步评估FLIM在孢粉学分析中的潜力，本研究重点研究了Sonneratia，这是一个具有复杂系统学和生态特征的代表性红树林属。Sonneratia（千屈菜科）在热带红树林生态系统中起着关键的先锋作用（Faridah-Hanum等人，2014年）。全球范围内，该属包含大约9个物种，其中6个分布在中国沿海地区（Wang和Chen，2002年）：S. ovata、S. apetala、S. × gulngai、S. alba、S. × hainanensis和S. caseolaris。其中，S. × hainanensis是中国特有的物种，而S. apetala是在20世纪80年代从孟加拉引入的（Ren等人，2009年；Wang和Wang，2007年）。这6个物种的花粉形态可以根据是否存在纵向脊以及极地和赤道区域之间的过渡特征分为四类（Mao等人，2009年）。在营养形态方面，S. alba具有卵形叶片，而S. caseolaris的叶片基部有红色脉络（Duke，2006年；Mao等人，2012年；Mao和Foong，2013年；Mao等人，2009年）。从生物地理学上看，Sonneratia物种的分布差异明显（图1a–f）。S. alba的分布范围最广，其次是S. caseolaris和S. apetala，而S. ovata的分布范围较有限（Duke，2006年）。S. apetala延伸到该属的最北端，而S. × hainanensis的分布范围非常狭窄，仅见于海南文昌（Duke，2006年；Duke和Jackes，1987年；Mao和Foong，2013年；Mao等人，2009年；Muller，1964年；Tomlinson，1986年；Wang和Wang，2007年）。从生态学上看，不同的Sonneratia物种在河口-海岸梯度上表现出明显的生态位分化，尤其是在潮汐高度和盐度方面（Duke，2006年；Mao和Foong，2013年；Mao等人，2009年；Parida和Jha，2010年；Wu等人，2020年；Zhou等人，2022年）。例如，S. alba通常生长在下游高盐度环境中（Chen等人，2011年；Feng等人，2020年），而S. caseolaris更常见于受淡水影响的上游河口区域（Duke和Jackes，1987年）；其他物种和杂交类群一般分布于中间生境（图1g–i）。化石证据表明，Sonneratia具有与新生代热带海岸环境变化相关的悠久进化历史（Bande和Prakash，1986年；Ellison，2008年；Germeraad等人，1968年；Graham，1976年；Graham和Graham，1971年；Kumaran等人，2017年），其花粉在沉积记录中保存良好，使其成为红树林古生态学重建的重要指标（Ellison等人，2004年；Graham，2013年；Muller，1964年，Muller，1978年，Muller，1981年；Tomlinson，1986年）。这些系统学、生态学和进化特征使得Sonneratia成为评估FLIM是否能够提高物种水平花粉鉴别能力以及提供超出传统形态学方法所能获得的生态信息的理想模型类群。

本研究旨在使用FLIM表征Sonneratia花粉的荧光寿命特性，并解决两个科学问题：（1）是否可以使用荧光寿命参数有效区分不同的Sonneratia物种；（2）荧光寿命特征是否可以反映生态或环境差异，从而支持红树林生态系统的古生态学重建。通过将荧光寿命分析与分类学和生态学视角相结合，本研究旨在建立一种新的、高效的方法学框架，为红树林生态系统研究提供参考价值。

这些物种的分布范围从大到小依次为：Sonneratia alba、S. caseolaris、S. × gulngai、S. ovata、S. apetala和S. × hainanensis（修改自Duke，2006年）。（g）这6个物种在不同潮间带（高、中和低潮间带）的分布。（h）这6个物种沿河流梯度的分布，包括上游、中游和下游环境（修改自中国湿地植物数据库）。（i）这6个Sonneratia物种的耐盐性（修改自中国湿地植物数据库）。

章节片段

样本采集

本研究中使用的6个Sonneratia物种的花粉样本采集自中国海南省海口（110.596°E，19.9344°N）和文昌（110.788°E，19.613°N）的自然种群。采样地点位于东海港和青兰港红树林保护区（图2），这些地方拥有保存良好且物种丰富的Sonneratia生境。具体来说，S. ovata、S. apetala和S. × gulngai的样本来自东海港，而S. alba的样本来自...

结果

图4展示了Sonneratia物种的数据。结果表明三种荧光团之间存在明显差异（图5a–c）。基于三个荧光寿命组分（τ?、τ?、τ?）的三维散点图如图5d所示，6个Sonneratia物种表现出不同的分布模式：Sonneratia apetala（蓝色）和S. alba（紫色）在图中分得很开，位于两端，而S. × hainanensis（橙色）和S. ovata（红色）...

整合花粉形态学、分子系统学和FLIM数据

Sonneratia（千屈菜科）在被子植物分类系统中被认为是一个相对基础的谱系（Byng和Christenhusz，2018年）。该属目前包含大约9个物种，其中6个分布在中国沿海地区（Wang和Chen，2002年），在本研究中研究的物种中，S. apetala是上个世纪引入中国的物种（Ren等人，2009年）。

在Sonneratia花粉的研究中，传统形态学提供了关键的结构信息，包括...

结论

本研究展示了荧光寿命成像显微镜（FLIM）在Sonneratia花粉的分类、生态评估和古生态学应用中的潜力。对中国6个Sonneratia物种的分析表明，FLIM可以根据花粉壁荧光寿命的差异将Sonneratia分为四类，其中τ?是主要的区分组分。FLIM数据与传统花粉形态学的对应关系进一步证实了...

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能会影响本文所述的工作。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（42472039）的支持。我们感谢Chen Xiao博士在样本预处理方面的宝贵建议，以及Xilong Wang在FLIM实验期间的指导。