《Talanta》：Visualizing the Penetration of Flavor Additives into Tobacco Leaf by Ambient Pressure Laser Desorption Ionization/Post-photoionization Mass Spectrometry Imaging
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风味添加剂在烟叶中的渗透行为及成像研究，采用大气压激光解吸电离/后光离子化质谱成像技术，5μm分辨率下观察到内源性代谢物与外源性模型分子（香兰素、柠檬酸、苹果酸）的分布差异，温度升高和湿度增强显著提升渗透效率，并成功解析商用风味添加剂的渗透过程。
吕春春|姜玉婷|王健|彭小梦|王文斌|杨萌|宁勇|胡永华|葛少林|舒俊生|刘成远|潘阳
中国科学技术大学国家同步辐射实验室，合肥230029，中华人民共和国
摘要
了解调味添加剂在烟草叶片包覆过程中的渗透行为对于烟草产品的生产至关重要。本文采用常压激光解吸电离/后电离质谱成像（AP-LDI/PI MSI）技术研究了调味添加剂在烟草叶片中的渗透情况。在常温条件下，使用聚焦激光束扫描添加了调味添加剂和未添加调味添加剂的烟草叶片截面，并通过掺杂剂辅助的后电离装置对解吸出的物质进行电离。该方法能够以5 μm的空间分辨率清晰地成像内源性代谢物和外源性模型风味分子的分布。研究发现，不同调味添加剂的渗透效率存在显著差异。提高温度和湿度可以通过促进分子热运动和加速角质层水合作用来增强渗透效率。最后，本文还可视化并评估了一种商业调味添加剂溶液的渗透过程，这为卷烟包覆技术提供了宝贵的指导。
引言
卷烟包覆技术是指对烟草叶片进行调味的过程，这对于开发具有良好感官品质和烟雾化学成分的烟草产品至关重要[1]。这项技术的发展旨在解决原始卷烟烟雾风味不足或减弱的问题，从而提升卷烟的辛辣和酚类香气，从而增强其风味效果[2]。烟草叶片的包覆效果直接决定了切割烟草的质量，进而影响后续产品的感官评价和消费者的吸烟体验。在包覆过程中喷涂的调味液被认为会被烟草叶片吸收并渗透进去，这对烟草叶片的质量起着关键作用[3]。
人们已经付出了大量努力来研究液体在植物叶片中的渗透过程。通过重量变化[4]、[5]或气相色谱-质谱（GC-MS）[6]等方法，已经表征了不同渗透时间内烟草叶片吸附的液体调味剂量，从而获得了烟叶对各种物质的吸附效率。然而，目前还缺乏关于液体在烟草叶片内部精确渗透深度的数据。值得注意的是，也有人尝试使用成像技术（如荧光显微镜成像）直接评估叶片内的渗透程度。Chen等人利用双光子共聚焦扫描激光显微镜[7]研究了菲在植物叶片角质层中的原位吸收情况。除了荧光显微镜之外，表面增强拉曼散射（SERS）也是一种强大的分子成像技术。2016年，Yang等人利用50纳米金纳米颗粒作为探针，通过共聚焦SERS成像技术监测了农药在菠菜叶片中的渗透行为，并研究了目标农药渗透的空间-时间动态[8]。相比之下，基于质谱的成像技术具有高灵敏度、高特异性且无需标记或探针的优点[9]、[10]、[11]、[12]、[13]。
已有几种质谱成像（MSI）方法被应用于植物叶片的逐层分子成像。2009年，激光烧蚀电喷雾电离质谱（LAESI MS）被用于成像白掌（Spathiphyllum lynise）和斑马叶（Aphelandra squarrosa）叶片组织中的代谢物，其横向和深度分辨率分别为约300 μm和30-40 μm[14]。虽然提出了一种基于激光烧蚀的三维成像方法，但其成像分辨率仍不够高。2024年，继续使用LAESI MS通过调节激光强度来研究农业制剂在小麦叶片中的渗透性[15]。尽管基于烧蚀的方法已被证明是研究植物叶片中多种化学物质深度分布的有效技术，但需要注意的是，烧蚀深度受叶片组织和材料的影响，因此每个像素和层次的烧蚀深度并不完全相同。此外，在烧蚀过程中需要不断调整样品台的高度以补偿烧蚀引起的深度变化。在高分辨率下成像植物叶片（如表皮、叶肉和毛状体）中的化学物质时，需要精确地对样本进行生物结构的空间对齐，这仍然具有挑战性。另一种策略是研究叶片组织内的化学物质分布。2018年，Li等人制备了厚度为16 μm的银杏叶片横截面切片，并使用基质辅助激光解吸电离（MALDI）MSI对其进行成像，实现了50 μm的空间分辨率[16]。需要注意的是，新鲜银杏叶片的厚度约为500 μm，这使得制备50 μm空间分辨率的横截面切片成为可能。然而，由于烟叶薄、脆且坚硬，制备烟叶横截面切片颇具挑战性。此外，对于烟叶横截面的成像来说，50 μm的空间分辨率也不够，因为烟叶的厚度通常已降至100-200 μm[17]、[18]、[19]。
在本研究中，采用常压激光解吸电离/后电离（AP-LDI/PI）技术研究了烟叶横截面上的调味添加剂渗透情况，分辨率为5 μm。在常温条件下，使用聚焦激光束扫描烟草叶片截面，然后通过后电离质谱仪对解吸出的物质进行电离和检测。基于这种策略，成功获得了烟叶横截面内源性代谢物和外源性调味添加剂的成像结果。此外，还仔细研究了时间、温度和相对湿度（RH）对各种模型风味分子在烟草叶片中渗透效率的影响。最后，通过分析一种商业调味添加剂的渗透过程进一步证明了该方法的适用性。
试剂和样品材料
高效液相色谱（HPLC）级甲苯、乙醇和丙二醇（纯度99%）分别从Merck（密歇根州马斯基根）和Aladdin Chemistry Co., Ltd.（中国上海）购买。氮气（纯度99.999%）作为载气，由南京特种气体厂有限公司（南京）提供。香兰素（99%）、柠檬酸（97%）和苹果酸（99.5%）由国药化学试剂有限公司和Aladdin Chemistry Co., Ltd.（中国上海）提供。
烟草叶片截面的MSI
从横截面来看，烟草叶片的解剖结构通常包括角质层、上表皮、叶肉层、下表皮和腺毛（图2A）。上表皮和下表皮都由单层细胞组成，其外表面覆盖着一层相对较薄的角质层。叶肉分为栅栏组织和海绵组织。栅栏组织位于上表皮下方，含有丰富的...
结论
在本研究中，为了追踪调味添加剂在烟草叶片中的渗透过程，使用AP-LDI/PI-MSI技术以5 μm的高空间分辨率研究了烟草叶片截面中内源性代谢物和外源性风味分子的分布特征。采用包含香兰素、柠檬酸和苹果酸的模型风味分子溶液，探讨了关键参数（如时间（1小时、3小时、5小时）对渗透效率的影响。
CRediT作者贡献声明
舒俊生：方法学设计、实验研究、资金获取、数据管理、概念构建。刘成远：撰写-审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、结果验证、项目监督、方法学设计、数据分析。潘阳：撰写-审稿与编辑、项目监督、资源调配、项目管理、方法学设计、实验研究、资金获取。吕春春：初稿撰写、数据可视化、结果验证、方法学设计、数据分析。
利益冲突声明
作者声明没有已知的利益冲突或可能影响本文研究的个人关系。
致谢
本工作得到了中国烟草安徽工业有限公司科技计划项目（编号2022340000340020）、国家重点研发计划（2021YFA1502600和2022YFA1505800）、国家自然科学基金（92045301）、安徽省科技创新平台重点项目（编号S202305a12020030）、CAS关键技术人才计划以及中国科学技术大学“双一流”研究基金的资助。
