《Talanta》：CRISPR/Cas and Isothermal Amplification in Pathogen Detection: Applications and Future Perspectives
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CRISPR/Cas与等温扩增（IA）技术整合为快速、便携的现场诊断提供新方案，通过纳米材料增强信号检测和智能化系统设计优化性能，应用领域涵盖公共卫生和食品安全，但仍需解决兼容性、成本及标准化问题。
邱文勇|欧阳欣怡|赵玉曦|康小曼|高航|刘浩龙|李坤祥|郭永灿
纳米生物传感与微流控即时检测技术，泸州临床实验室重点实验室，西南医科大学附属中医医院，中国泸州646000
摘要
传统的病原体检测方法通常受到检测周期长和依赖实验室环境的限制。将CRISPR/Cas系统与等温扩增（IA）技术结合，已成为实现快速、准确且可在现场应用的分子诊断方法的一种有前景的方式。本文系统地概述了CRISPR-Cas与IA集成平台的基本原理、优化策略及最新进展，强调了协同机制如何提高检测灵敏度，并探讨了创新集成策略（如物理隔离、化学调控和智能系统设计）以解决关键兼容性问题。同时，详细讨论了纳米材料在增强信号放大和促进系统集成方面的作用。尽管在稳定性、成本和标准化方面仍存在挑战，但未来在智能设计、便携设备开发和定量方法方面的进步有望使这项技术成为公共卫生控制、食品安全监测及相关领域的多功能平台。本文为从事即时检测和诊断技术研究的人员提供了全面的视角和方法参考。
引言
病原微生物（包括病毒、细菌、真菌和寄生虫）对全球公共卫生构成严重威胁。流感、肺炎和食源性疾病等传染病不仅危及个人健康，也给公共卫生系统带来巨大负担[1]。虽然传统的培养基检测方法仍是微生物检测的金标准，但其较长的检测周期（从几天到几周不等）可能导致诊断和治疗的延误[2]。聚合酶链反应（PCR）技术凭借其高灵敏度和特异性，被视为分子诊断的金标准[3]。然而，其应用通常需要在专业实验室中使用热循环仪，整个过程包括核酸提取、扩增和数据分析等多个步骤。近年来，快速PCR技术已成功将扩增时间缩短至30分钟以内[4]。然而，简化整个工作流程和降低设备成本仍是实现其更广泛即时应用的关键目标[5]、[6]、[7]。因此，迫切需要开发适用于即时检测和精准疾病诊断的快速、简单且经济高效的检测技术。
近年来，将规律间隔短回文重复序列（CRISPR/Cas）与等温扩增（IA）技术结合已成为一种有前景的解决方案[8]、[9]。CRISPR/Cas系统最初来源于细菌的适应性免疫机制，因其可编程的核酸识别和切割能力而被重新用于分子诊断[10]、[11]、[12]、[13]。这些系统利用引导RNA（gRNA）进行特异性目标识别，并通过Cas蛋白的切割作用实现信号放大，支持多种读数方式（如荧光、比色法和电化学方法），同时具备单碱基分辨率和多重检测能力[14]。然而，其灵敏度仍受初始目标浓度和潜在脱靶效应的限制[15]。同时，IA技术（如环介导等温扩增（LAMP）、重组酶聚合酶扩增（RPA）和滚环扩增（RCA）能够在恒定温度下高效扩增核酸，具有反应快速、操作简便和设备要求低等优点，非常适合即时检测和资源有限的环境[16]。不过，这些方法容易因非特异性扩增而产生假阳性结果[17]。
CRISPR/Cas与IA技术的结合利用了各自的优点，同时克服了各自的局限性[18]。IA技术实现快速目标扩增，提高了灵敏度，而CRISPR/Cas确保了扩增产物的特异性识别，显著减少了假阳性结果。例如，CRISPR/Cas系统通过gRNA介导的识别实现了单碱基分辨率，有效抑制了IA引起的非特异性扩增信号[19]。此外，Cas蛋白的切割作用可将信号放大至阿托摩尔（aM，10-18 M）水平，克服了检测低丰度目标的限制[20]。该系统无需复杂仪器即可将核酸信号转化为易于解读的输出（如荧光、侧向流动或电化学信号），同时支持多重检测[21]。目前，这种集成策略在检测人乳头瘤病毒（HPV）、严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）等病原体方面表现出优异性能，通过与CRISPR/Cas系统的有效整合和优化，整个检测过程可在60分钟内完成，灵敏度达到阿托摩尔级别，实现了从实验室研究向实际应用的转变。
然而，实际应用仍面临诸多挑战，包括反应系统兼容性、引物和crRNA设计、自动化集成、成本控制以及临床转化等问题。最近的研究通过优化CRISPR/Cas和IA组件（如人工智能辅助设计、新型Cas蛋白开发和酶工程），以及创新集成策略（如物理隔离、化学调控和智能系统集成）解决了这些问题。此外，纳米材料的加入进一步提升了信号放大能力，实现了多模式检测，扩展了系统的性能和应用范围。
张等人[22]系统回顾了CRISPR/Cas与IA集成平台在核酸即时检测（POCT）中的广泛应用，涵盖了病原体、SNP和miRNA等多种目标的基本原理和检测方法。尽管内容全面，但他们的综述更侧重于广度而非深度，对反应兼容性、脱靶效应及纳米材料辅助检测和智能系统集成等核心问题的讨论较为有限。
在此背景下，本文在系统阐述CRISPR/Cas与IA集成基本原理的基础上，重点介绍了优化策略、集成方法、纳米材料辅助增强和信号读出系统的最新进展，总结了关键挑战，并展望了向智能、便携、定量和多重检测平台发展的方向。旨在为传染病控制、食品安全和环境监测等领域的应用提供理论见解和实践指导。
CRISPR/Cas与IA集成原理
CRISPR/Cas系统因其可编程的目标识别和催化信号放大能力而被誉为“下一代分子诊断技术”[23]。然而，如果没有预扩增步骤，该系统往往无法产生足够强的检测信号，这严重限制了其在病原体检测中的应用。相比之下，IA技术能够在恒定温度（通常为37–65°C）下实现快速核酸扩增，无需额外设备。
CRISPR/Cas与IA的集成策略
CRISPR/Cas与IA的结合通过协同作用具有显著价值。然而，由于最佳反应条件（如温度、离子浓度和酶需求）的差异，以及Cas蛋白切割活性在早期扩增过程中可能导致的脱靶效应，使得无缝集成面临挑战。为解决这些问题，研究人员基于物理隔离等策略进行了创新设计（见图3）。
纳米材料增强型CRISPR/Cas-IA集成检测
近年来，纳米材料由于其独特的物理化学性质（如高表面积与体积比、可调的光电特性和优异的生物相容性[66]，在核酸扩增、信号增强和检测读出方面展现出巨大潜力。在CRISPR/Cas-IA集成检测系统中，不同功能的纳米材料发挥着重要作用（见表3），显著提升了整体检测性能。
荧光检测
荧光检测是CRISPR/Cas-IA集成技术中最常用的信号读出方法之一。其原理是基于Cas蛋白（如Cas12a、Cas13a）在识别目标核酸后激活切割活性，导致反应系统中游离的单链DNA或单链RNA探针发生非特异性切割[77]。这些探针通常标记有荧光团和淬灭剂；通过F?rster共振能量转移（FRET）效应，
总结与展望
本文系统回顾了CRISPR/Cas系统与IA技术在病原体检测中的最新应用进展。通过分析基本原理、优化策略、集成方式以及纳米材料和信号检测方法的作用，可以看出该领域已从初步的概念验证阶段发展为深入优化的阶段，正逐渐成为多功能诊断平台。
作者贡献声明
刘浩龙：数据可视化、数据整理。
郭永灿：撰写与编辑、监督、资源管理、项目规划、方法学设计、资金申请。
李坤祥：数据可视化、数据整理。
邱文勇：初稿撰写、数据可视化、方法学设计、实验设计、数据整理。
赵玉曦：数据可视化、数据整理。
欧阳欣怡：数据可视化、数据整理。
高航：数据可视化、数据整理。
康小曼：数据可视化、数据整理
利益冲突声明
? 作者声明没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。
致谢
本项工作得到了
西南医科大学（项目编号：2023ZYQJ01）的支持。
