《Synthetic and Systems Biotechnology》：Advances in detecting category A biothreat agents: Toward symptom-driven sensing strategies
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本文系统回顾了针对炭疽、鼠疫、土拉菌病、病毒性出血热、痘病毒及肉毒中毒等A类生物威胁因子的最新生物传感平台，重点总结了其诊断靶点、信号放大策略（如CRISPR、金属有机框架MOF、SERS、电化学传感等）及技术优化方法。综述探讨了症状驱动的快速检测策略，旨在建立传感技术与临床应用的系统性关联，为应对生物恐怖主义、流行病和公共卫生事件中的医疗资源配置研究提供支持。
开发中的传感技术
生物传感器通过生物识别元件（如DNA、适配体或单克隆抗体）与其靶标（如细菌、病毒或毒素）之间的特异性相互作用，将生物事件转换为可测量的电化学、光学等信号。检测技术可根据其分析机制大致分为三类：基于物理检测的方法（如质谱、色谱、表面等离子体共振SPR、石英晶体微天平QCM），它们精度高但通常依赖复杂、非便携的设备；基于生化检测的方法（如抗体检测、核酸测试，特别是侧向流动免疫层析LFI和基于CRISPR的技术），它们适用于即时检测POC或现场测试；以及新兴的变革性传感器（如电化学、光学和光电化学PEC平台），它们在便利性和灵敏度上超越了传统方法，但仍在稳定性和准确性上面临挑战。评估灵敏度、特异性、检出限LOD、动态范围、重复性等关键分析参数对于评估技术的实际适用性至关重要。为了优化性能，研究者们采用了多种策略，例如使用具有高亲和力的单克隆抗体和适配体来替代传统抗体，利用等温扩增技术克服对热循环仪的依赖，以及利用纳米材料（如金、碳或其纳米复合材料）来扩大传感器表面、加速电子转移、放大信号。此外，结合微流控技术和可视化系统可以进一步提高操作的便利性。
A类生物威胁因子的传感平台
炭疽传感平台
炭疽杆菌以营养细胞和孢子两种形式存在，其孢子对环境具有极强的抵抗力。其致病性主要由两个质粒pXO1和pXO2编码的毒素和荚膜基因控制，这些基因是主要的检测靶点。为了克服实时荧光定量PCRRT-qPCR热循环时间长的缺点，研究人员开发了基于空心金纳米粒子HAuNPs和磁珠MBs的表面增强拉曼散射PCRSERS-PCR传感平台，该平台利用三维MB表面的富集能力和HAuNPs的电磁增强效应，仅需5个热循环即可实现有效检测。为了推进资源有限地区的现场检测，有研究将重组酶聚合酶扩增RPA与CRISPR/Cas12a以及基于G4-DNAzyme的可视化读数系统结合，靶向新颖的CR5位点，实现了低至1拷贝/反应的高灵敏度检测。对于炭疽孢子，其标志性生物标记物吡啶二羧酸DPA的检测是研究热点。以镧系金属有机框架LMOFs为代表的荧光探针被广泛应用。例如，基于铈/铕或铽/铕的双镧系离子MOF，利用DPA引入后对金属离子间能量转移的调控，实现了比率型荧光传感。也有研究开发了基于单配体、单金属的双发射LMOF，或将其与其他发光材料（如碳点CDs）复合，以构建更经济、环保的传感平台。此外，集成了磁性分离、分子捕获和电荷转移功能的多功能CoFe2O4/APTES/Ag核壳杂化材料被用于构建POC SERS传感器，实现了复杂基质中DPA的直接、灵敏检测。对于炭疽毒素，保护性抗原PA是关键的生物标志物。有研究开发了基于金纳米棒阵列AuNRAs和适配体的竞争性SERS检测方法，利用“三重热点”效应将检出限降至1 pg/mL。
鼠疫传感平台
鼠疫的实验室确诊建议通过基于PCR的方法靶向至少两个遗传标记（如pla、caf1、ypo2088、ypo2486）。基于此，已开发出靶向ypo2088、caf1和pla的三重微滴数字PCRddPCR检测方法。在CRISPR诊断方面，有研究将RAA（重组酶辅助扩增）与CRISPR/Cas12a及G-四链体DNAzyme比色法结合，靶向新的特异性基因序列CH57_3927，适用于资源有限的环境。在蛋白检测方面，鼠疫耶尔森菌的荚膜蛋白F1抗原和毒力因子LcrV（V抗原）是常用靶点。有研究开发了同时靶向LcrV和F1蛋白的侧向流动免疫层析LFI。为了提升灵敏度，引入了具有优异光学特性的双金属银包金纳米星BGNS，或将上转换纳米颗粒UCNPs作为信号标签，结合电渗流EOF驱动的免疫层析技术EICA。无标记光学传感技术也有进展，例如基于金纳米粒子-聚合物复合双条纹纳米线阵列APDW的反射光谱法，或基于一维衍射光栅的衍射光学法，通过抗原-抗体结合改变光栅结构的规律性来调制信号。
土拉菌病传感平台
目前尚无FDA批准的用于土拉弗朗西斯菌抗原检测的快速POC诊断测试。在基因检测方面，针对高度保守的TUL4基因，有研究同时采用了实时RPA RT-RPA和RPA-CRISPR/Cas12a两种方案，后者在40分钟内实现了0.5拷贝/反应的超高灵敏度。在蛋白检测方面，脂多糖LPS和外膜蛋白AOmpA是潜在的诊断抗原。一项研究设计了基于金纳米星GNS的高灵敏度近红外光热LFI平台，利用GNS的光热转换效率，通过智能手机集成的热成像相机捕获信号，实现了3.5 pg/mL的卓越检出限。
病毒性出血热VHF传感平台
病毒性出血热主要由丝状病毒（如埃博拉、马尔堡病毒）和沙粒病毒（如拉沙病毒）引起。在基因检测方面，有研究开发了RPA-CRISPR/Cas13a检测方法，靶向L基因，并与免提取样本加热灭活核酸酶技术HUDSON结合，通过侧向流动试纸条和荧光检测读取结果，实现了低成本、高安全性的POC检测。为了在不牺牲准确性的前提下提高灵敏度，有研究在CRISPR/Cas13a系统中引入了后续扩增策略，利用功能化DNA-金纳米粒子和催化发夹自组装CHA反应进行信号放大。为了集成和自动化，还开发了“升举加热”式离心微流控平台Lift-CM，通过空间编码离心盘分隔等温扩增和CRISPR/Cas12a检测过程，实现了闭管操作，防止了气溶胶污染。在蛋白检测方面，病毒蛋白VP40和分泌型糖蛋白sGP是重要标志物。有研究利用噬菌体展示筛选出的单链捕获抗体，结合抗污聚合物刷涂层和便携式宽场荧光阅读器，开发了高灵敏度的sGP检测平台，检出限低至20 pg/mL。还有研究将LFA与等离子体荧光团PFs结合，或开发了纳米抗体功能化的纳米颗粒检测法Nano2RED，通过加速金纳米颗粒聚集和分光光度法分析，实现了快速、高灵敏的抗原检测。
正痘病毒传感平台
针对天花和猴痘等正痘病毒，CRISPR检测方法被广泛采用，通常与RPA、MIRA、HAD、RCA等各种等温扩增技术结合，形成一体化自扩增系统。例如，有研究利用低成本肝素钠调节Cas12a的顺式切割活性，开发了通用、单管的RPA-CRISPR荧光检测法。另一项研究将CRISPR-Cas12a与相位询问式表面等离子体共振成像SPRi结合，利用Cas12a切割金纳米粒子-单链DNA探针引起表面折射率变化，实现了无需扩增、实时、多重核酸检测，灵敏度达到1 aM。为了快速鉴别多种皮肤病原体，有研究开发了结合磁珠核酸提取和冻干比色环介导等温扩增LAMP技术的便携式POC设备，可同时检测正痘病毒、猴痘病毒（进化支I和II）和水痘-带状疱疹病毒VZV。在蛋白检测方面，位于病毒粒子外部的A29蛋白是理想抗原。基于差分脉冲伏安法DPV的电化学传感器，或基于干涉反射成像传感器IRIS的光学平台，都已用于A29蛋白的检测。为了推进集成提取和诊断的便携设备，还设计了微针MN传感器，用于直接从皮肤病变处提取猴痘病毒并进行电化学和比色双模式检测。
肉毒中毒传感平台
肉毒杆菌神经毒素BoNT的检测可通过评估其生物活性或酶活性（如小鼠致死试验MLA）实现，也可采用非功能依赖性方法，如直接蛋白质检测或抗体检测。在毒素生物活性检测方面，有研究开发了基于EGFP的FRET分子传感器来分析BoNT/A的内肽酶活性。受商业验孕试纸条启发，还开发了基于磁纳米颗粒和hCG功能化肽的传感平台，利用BoNT/A水解肽链释放hCG，从而被验孕试纸条检测。首款无抗体纸基传感器也已被开发，用于检测BoNT/A和BoNT/C。在免疫分型检测方面，高分辨率质谱HR-MS方法可用于血清分型和高通量分析。为了提高灵敏度、缩短检测时间并实现现场检测，有研究开发了基于SiO2/Si的法布里-珀罗干涉仪平台，通过竞争免疫测定和内肽酶活性分析来鉴定毒素类型和评估活性。此外，还开发了手持呼吸分析仪，通过识别丙酮、苯乙烯等五种潜在的BoNT中毒挥发性生物标志物，提供实时、无创的早期预警。
