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超氧阴离子溶酶体成像探针X100的开发及其在心肌纤维化筛选中的应用，通过罗丹明荧光基团与超氧响应磺酰基结合，实现了溶酶体特异性超氧检测，结合高通量筛选发现Schaftoside和Glycitein通过调节溶酶体功能及抗氧化实现纤维化缓解，而Daucosterol独立于超氧清除发挥作用。
谢一石|崔一欣|邢旭东|荆志扬|周毅|冯春玲|戴汉林|杨华|李萍|哈吉·阿克贝尔·艾莎
中国科学院新疆物理化学技术研究所新疆本土药用植物资源利用国家重点实验室，乌鲁木齐，830011，中国
摘要
准确可视化溶酶体内的超氧阴离子（O?•-）对于阐明氧化应激信号传导及其在氧化应激诱导的纤维化中的作用至关重要。在本研究中，通过将罗丹明荧光团与对O?•-敏感的磺酰基团偶联，开发了一种靶向溶酶体的荧光探针（X100）。当与超氧阴离子反应时，X100表现出强烈的荧光增强反应和高选择性。由于其出色的灵敏度和生物相容性，X100能够实现对TGF-β1诱导的成纤维细胞活化过程中溶酶体内O?•-积累的成像。通过将X100整合到高内涵筛选（HCS）平台中，鉴定了九种天然产物作为溶酶体O?•-调节剂，其中五种显著降低了α-SMA和Collagen I的表达。此外，多参数表型分析表明，Schaftoside和Glycitein可以通过调节溶酶体功能和减轻氧化应激来缓解心肌纤维化，而Daucosterol则独立于O?•-的还原发挥抗纤维化作用。本研究提供了一种可靠的溶酶体超氧阴离子定量分析工具，并建立了一种将氧化还原稳态与抗纤维化药物发现联系起来的筛选策略。
引言
心肌纤维化是包括心力衰竭和心肌梗死在内的多种心脏疾病的常见病理终点[1]。其特征是细胞外基质过度沉积，这会破坏心肌结构并损害心脏功能，最终导致临床预后不良的心力衰竭[2]。越来越多的证据表明，氧化应激在启动纤维化重塑过程中起着重要作用[3][4][5][6][7]。在各种活性氧（ROS）来源中，超氧阴离子（O?•-）既作为其他活性物质（如H?O?）的前体，又是激活促纤维化途径（如TGF-β/Smad信号级联）的关键信号分子[8]。因此，实时监测O?•-的动态对于理解氧化应激驱动的心肌纤维化以及发现新的治疗干预措施至关重要。
除了众所周知的降解功能外，溶酶体越来越被认为是具有氧化还原活性的细胞器[9,10]。在病理应激下，由NADPH氧化酶（NOX）和其他来源产生的ROS可能加剧溶酶体相关的氧化应激，破坏溶酶体的氧化还原稳态并损害其完整性和功能（例如溶酶体膜通透性和组织蛋白酶泄漏[11][12][13][14]。这些以溶酶体为中心的改变与炎症和促纤维化信号通路的激活有关，包括TGF-β相关通路，从而促进成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化以及细胞外基质的沉积[15,16]。在心脏重塑/纤维化相关的情况下，越来越多的证据表明，溶酶体功能障碍会促进成纤维细胞的活化、过多的胶原蛋白产生以及不良的重塑[17][18][19][20]。此外，溶酶体与线粒体之间的相互作用可能形成一个正反馈循环：线粒体产生的ROS会加重溶酶体损伤，而受损的溶酶体清除/自噬功能会进一步放大细胞氧化应激[21,22]。类似的溶酶体氧化应激相关机制也在多种纤维化疾病中得到报道，包括肝脏[23,24]、肾脏[25,26]和肺部纤维化模型[27]。然而，在心脏纤维化相关模型中直接和动态地可视化溶酶体内的O?•-仍然有限，这突显了需要一种靶向溶酶体的成像工具来解析亚细胞氧化还原动态，并支持更注重机制的抗纤维化候选药物的筛选（图1）。
小分子荧光探针由于其高灵敏度和时空分辨率，已成为在活体系统中可视化超氧阴离子的强大工具[28]。然而，大多数广泛使用的非靶向探针提供的是全细胞水平的氧化读数，无法区分来自不同亚细胞区的O?•-信号，这可能会在表型筛选中混淆机制解释[29,30]。近年来，已经开发出针对特定细胞器的O?•-探针，以解析特定区域的氧化还原动态，并已被证明对机制导向的研究和筛选应用非常有用[31][32][33][34]。尽管取得了这些进展，但仍需要具有经过验证的选择性和在溶酶体酸性条件下稳健性能的靶向溶酶体的O?•-探针，特别是用于实时成像和纤维化相关模型的筛选。为此，我们设计了X100，以实现溶酶体限制性的O?•-可视化，并支持针对抗纤维化候选药物的机制导向表型筛选。
在这项工作中，我们采用了高内涵成像（HCI）作为一种先进的分析策略，它将细胞器特异性荧光检测与定量表型分析相结合。通过自动化图像采集和多参数分析，该方法能够同时评估与成纤维细胞活化相关的亚细胞O?•-动态和形态变化。通过将开发的靶向溶酶体的O?•-探针（X100）与HCI结合，我们建立了一个定量成像平台，能够识别调节溶酶体氧化应激并减轻纤维化相关表型的天然产物。这种综合策略将化学探针的开发与功能性天然产物药物发现联系起来，旨在发现新的O?•-调节剂并在细胞纤维化模型中对其进行验证。我们预计探针X100将成为研究溶酶体O?•-病理生理机制的强大化学工具，并为针对氧化应激相关纤维化疾病的药物开发提供有价值的支持。
材料与仪器
除非另有说明，所有试剂、有机溶剂和生物分析物均从商业供应商（Alladin、Adamas-beta、TCI等）购买，并直接使用，无需进一步纯化。
化合物X100的合成
化合物X100是以2-(2,4-二羟基苯甲酰)苯甲酸和1-(3-羟基苯基)哌嗪为起始材料合成的。中间体的合成步骤在支持信息中有详细描述。如图1所示，从上一步获得的Boc保护的中间体...
探针X100的合理设计、合成和响应机制
近年来，已经报道了几种用于超氧阴离子成像的靶向溶酶体的荧光探针。例如，Lu等人[40]开发了一种水溶性荧光探针，具有双线粒体/溶酶体靶向性，可用于活细胞和斑马鱼中的选择性超氧阴离子检测。Ma等人[41]报道了一种双光子靶向溶酶体的探针（Lyso-MHC），用于活细胞和斑马鱼中内源性超氧阴离子的成像，并进一步展示了其在组织模型中的实用性。
结论
总之，本研究开发了一种稳健的靶向溶酶体的荧光探针X100，用于检测超氧阴离子（O?•-），并展示了其在表型药物筛选（PDD）中的有效应用。除了其出色的光物理性质和高选择性外，X100还建立了一个高内涵筛选平台，直接将溶酶体O?•-的调节与抗纤维化效果联系起来。这一策略导致了几种有前景的天然化合物的鉴定...
CRediT作者贡献声明
谢一石：撰写——原始草稿、验证、方法学、研究、正式分析。崔一欣：撰写——审阅与编辑、项目管理、方法学。邢旭东：撰写——审阅与编辑、项目管理、方法学。荆志扬：正式分析、数据管理。周毅：验证、正式分析。冯春玲：可视化、正式分析。戴汉林：可视化、数据管理。杨华：监督、资金获取、概念构思。李萍：
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了国家重点研发计划（编号2022YFC3502000）、江苏省自然科学基金（编号BK20253058）以及江苏省优秀博士后人才资助计划（编号2025ZB837）的支持。
