《Synthetic and Systems Biotechnology》：Yeast species resource exploration and application in cell factories
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本文系统评述了酵母细胞工厂领域的最新进展，聚焦酵母种质资源开发、赋能技术创新和高效生物合成策略，总结了S. cerevisiae、K. phaffii、Y. lipolytica等工业酵母的特性与应用，并探讨了基于CRISPR、合成生物学工具、动态调控、基因组规模代谢模型(GEM)和AI驱动设计等先进技术实现产物滴度、得率和生产速率(TRY)提升的优化方案，为下一代酵母平台的理性设计与工业应用提供了前沿洞见。
在应对全球化石燃料消耗剧增和实现碳中和的双重挑战下，绿色生物制造正在成为替代传统化工产业、可持续生产高价值生物基化学品的关键途径。微生物细胞工厂，特别是酵母基系统，凭借其高效的代谢网络、成熟的遗传操作平台和工业可扩展性，已成为这一转型的核心。作为单细胞真核模式生物，酵母不仅具备复杂的翻译后修饰能力，还能通过合成生物学工具精确重构代谢途径，在合成天然产物和碳捕获方面展现出独特优势。
酵母种质资源
酵母作为单细胞真核模式生物，因其完善的遗传操作平台、高度可重构的代谢网络以及在工业环境中的显著鲁棒性，已成为合成生物学和代谢工程中基础性的底盘细胞系统。一个全球建立的、涵盖多个物种并具有独特代谢特征和生物合成能力的多样化酵母种质资源库，为合成生物学应用提供了基础平台。
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常用工业酵母底盘的特点
作为传统的工作马，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)一直是构建酵母细胞工厂的首选底盘。然而，在某些应用场景中观察到的局限性使得关注点转向了其他新型酵母。这些新型酵母通常从极端或特殊生态位中分离，拥有丰富的新型代谢能力、独特的生理特性和与生俱来的耐受性，使其非常适合应对特定的生物制造挑战。对这些替代底盘的探索和工程化正在不断拓展酵母基生物生产的疆界。
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酿酒酵母：作为第一个完成全基因组测序的真核模式生物，其核心优势在于全基因组解析、模块化基因编辑工具和标准化的合成生物学元件库。在高葡萄糖条件下，酿酒酵母会表现出克雷布斯效应，其特征是优先转向糖酵解，并将丙酮酸转化为乙醇。通过操纵糖磷酸化或敲除泛素化酶基因UBP3等策略，可以改变酵母的代谢模式，减弱克雷布斯效应，促进呼吸代谢。
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Komagataella phaffii：这种甲基营养型酵母最初从橡树中分离，具有利用甲醇作为唯一碳源的独特能力。其卓越的蛋白质分泌能力根本上得益于其内质网内高效且保真的蛋白质折叠质量控制系统。近年来，CRISPR-Cas9介导的方法实现了高效、无标记的多基因敲入，显著加速了其作为合成生物学底盘的发展。SynPic-X是一个可编程的酵母表达平台，提供了新型的“即插即用”合成生物学底盘，集成了合成转录放大器与正交CRISPR干扰/激活系统。
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Kluyveromyces marxianus：最初从葡萄中分离，以其耐热性和广泛的底物谱为特征，可代谢葡萄糖、乳糖和菊粉等糖类。其耐热性显著降低了冷却要求并最大限度地降低了污染风险。尽管CRISPR-Cas9和Cre-loxP系统已成功应用于马克斯克鲁维酵母，但其编辑效率仍受多种因素限制。由于对代谢理解的局限，目前增强产物合成的策略仍主要依赖于关键基因的过表达和竞争途径基因的敲除。
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Yarrowia lipolytica：作为一种严格好氧的二型态酵母，最初从香肠加工厂的富含脂质的腐败材料中分离。作为克雷布斯效应阴性的酵母，与酿酒酵母相比，其在培养过程中产生的乙醇可忽略不计，从而消除了乙醇引起的产物抑制。其广泛的底物谱，包括甘油和烷烃，显示了其巨大的工业潜力。通过引入正交前体途径以增强乙酰辅酶A和NAD(P)H的供应，并重构中心代谢，实现了从葡萄糖高水平生产β-法尼烯。DeepGuide算法的开发，能够准确预测解脂耶氏酵母中CRISPR-Cas9和CRISPR-Cas12a的向导RNA活性。
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酵母平台在工程细胞工厂中的应用
在加速向绿色经济转型的背景下，生物制造正通过其在复杂分子合成中的精确调控能力，彻底改变高附加值化合物的生产模式。前述酵母细胞工厂在重构高等真核生物代谢途径方面，相较于原核底盘细胞，因其在亚细胞结构和代谢网络上的高度相似性而展现出显著优势。通过利用合成生物学技术重构代谢网络，这些平台能够从低成本原料（包括葡萄糖、木质纤维素生物质、合成气和甲烷）高效生物合成高价值生物基化学品。
酵母细胞工厂的赋能技术
高效酵母细胞工厂的构建类似于一个精密工程问题，需要在“元件”和“系统”两个层面进行操作。在“元件”层面，多样化的遗传调控元件是微调单个基因表达水平的基石。在“系统”层面，CRISPR技术为在复杂的基因组和转录组中进行全局和高通量干预提供了强大平台。它们共同构成了酵母代谢工程的核心技术工具箱。
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遗传调控元件：代谢工程的基础设计框架
遗传调控元件——包括启动子和终止子——作为代谢途径组装的模块化构件，能够精确控制基因表达的时空强度和上下文依赖性响应。酵母代谢工程的成功关键取决于对这些元件的系统性挖掘和工程化，以实现代谢通量的合理分配。
启动子作为上游调控元件，通过招募RNA聚合酶和转录因子来协调转录起始，是代谢工程中平衡基因表达与细胞资源分配的关键组件。基于其表达模式和设计策略，启动子可分为组成型、诱导型和合成型三类。合成启动子通过合理设计转录因子结合位点来编程基因表达逻辑和强度，适用于需要动态调控和多个基因精确协调的复杂代谢网络。
终止子作为转录单元的下游调控元件，在酵母代谢工程中协调转录终止和mRNA稳态调节。其功能机制依赖于两个关键的分子事件：终止子通过保守序列基序招募RNA聚合酶II终止复合物，介导转录终止并抑制通读以确保基因独立表达；3‘非翻译区中的多聚腺苷酸化信号和AU富含元件通过调节poly-A尾形成以及与RNA结合蛋白的相互作用，动态平衡mRNA的核质转运、翻译活性和降解速率。
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CRISPR：高效基因组编辑与调控系统
CRISPR源于原核适应性免疫系统，自2012年Doudna和Charpentier团队在体外重建CRISPR/Cas9系统并展示其RNA引导的DNA靶向和切割能力以来，彻底改变了基因组编辑范式。凭借其可编程性、高效率和多功能性，CRISPR已成为酵母代谢工程中基因组编辑和动态调控的核心工具。
CRISPR-Cas9系统通过将Cas9诱导的DNA双链断裂与同源定向修复相结合，实现酵母中的精确基因组编辑。
CRISPR-Cas12a系统识别TTTN PAM并产生交错切割，为修饰GC富集的基因组区域提供了一个独特的平台，克服了Cas9核酸酶的局限性。
CRISPR-Cas12f代表了一类超紧凑的V-F型效应器，虽然天然效率较低，但工程化的Cas12f变体在病毒载体递送方面显示出潜力。
Cas13是一种RNA引导的RNA内切酶，通过CRISPR RNA实现RNA靶向切割，是酵母研究中一种精确的非基因组编辑工具，其核心优势在于动态基因表达调控。
CRISPR干扰和CRISPR激活构成了一个多功能转录调控工具包。CRISPRi使用与阻遏结构域融合的催化失活Cas9，在靶向基因启动子时，空间位阻地阻断转录起始。相反，CRISPRa利用与激活结构域融合的dCas9来招募转录机制，从启动子或增强子上调基因表达。两者均在不诱导DNA双链断裂的情况下发挥作用，实现了可逆的表观遗传调控，同时最大限度地降低了基因毒性风险。
酵母细胞工厂的高效生物合成策略
高性能酵母细胞工厂的构建是一项系统生物学事业，其核心是细胞代谢网络的精确设计与重构。主流的优化策略可分为三个关键维度。在调控策略方面，代谢途径的动态调控为时空控制提供了复杂手段，而转录因子工程则能全局掌握多重代谢途径。在设计与预测层面，基因组规模代谢模型驱动的优化为理性设计和整体视角提供了强大框架。针对核心瓶颈的解决，生长与生产的权衡策略研究致力于优化细胞资源分配，而辅因子工程则专门解决合成途径内能量和还原当量的供应瓶颈。
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代谢途径的动态调控
传统的静态控制策略通常受限于其无法响应细胞内动态变化的生理状态，经常导致代谢失衡、资源竞争和中间代谢物毒性等问题。为解决这些挑战，代谢途径的动态调控已成为一种有前景的替代方案。这种方法巧妙地将基因表达与特定的细胞内或细胞外信号联系起来，从而实现代谢通量的精确时空控制。
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用于全局代谢调控的转录因子工程
转录因子在酵母代谢工程中发挥着核心作用，它通过协调基因簇的时间调控来实现动态的途径协调。转录因子工程超越了直接修饰已知调控元件的范畴，还包括通过系统生物学方法发现新的调控网络，从而为细胞重编程提供新的靶点。
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GEM驱动的优化
基因组规模代谢模型是用于酵母细胞工厂理性设计和全局优化的核心计算生物学工具。通过整合基因组注释、生化反应网络和酶动力学约束，GEMs构建了能够模拟细胞全局代谢状态的数学模型。
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生长与生产间的动态权衡
在构建酵母细胞工厂时，一个基本瓶颈在于细胞内资源的固有局限性。快速的细胞生长和目标产物的高效合成都是高耗能的生物过程，这不可避免地在这个共享的资源池中形成竞争动态。这种固有的生长-生产权衡常常引发溢出代谢的典型现象，即细胞将多余的碳通量转向副产物的合成而非目标化学品，最终限制了最终滴度和得率。
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用于氧化还原与能量平衡的辅因子工程
辅因子工程的核心目标是动态、高效地平衡细胞内能量和还原当量的供应与异源途径带来的巨大需求。
结论与展望
本综述系统总结了酵母细胞工厂领域的最新进展，涵盖了酵母种质资源挖掘、赋能技术创新和高效生物合成策略。合成生物学与系统生物学的深度融合正在推动酵母细胞工厂从基础研究到工业转化的范式转变。通过在酵母底盘细胞中利用酵母种质资源、实现技术创新和采用先进合成策略，在萜类、黄酮类和生物燃料的绿色制造方面取得了显著进展。
然而，在将现有技术框架与复杂的工业需求对接方面仍存在关键挑战。传统的静态调控方法通常无法解决细胞生长与产物合成之间的权衡。复杂途径的异源表达经常引发代谢冲突，而在大规模发酵下菌株不稳定和适应性差的问题仍然存在。要超越这些局限，需要从局部优化向系统级重新设计进行根本性转变，以促进酵母细胞工厂的多维度和动态调控工程。
未来的进展将依赖于多个前沿领域的融合。智能设计框架将发挥核心作用，人工智能和机器学习将深度嵌入设计-构建-测试-学习的整个循环。多组学数据的整合将增强预测性数字模型的能力，自动化设计过程，并大幅缩短开发时间。此外，工程策略将超越代谢途径，扩展到全局细胞重构——例如重编程细胞器、利用非经典分泌机制增强蛋白质运输，以及构建合成微生物群落以实现分布式高效的途径执行。
同样重要的是开发碳中性的生物制造系统。未来的努力将集中于从基于糖的原料向新型碳源（如CO2、C1化合物、塑料衍生单体和木质纤维素水解产物）的过渡。解锁基因组“暗物质”和表观遗传调控网络的功能潜力将进一步增强细胞的效率和鲁棒性。通过结合节能发酵工艺，下一代酵母平台有望将高生产率、稳定性和可持续性结合起来，最终确立其作为未来生物经济基石的
