《Talanta》：Development of a single-cell ICP-MS method for element analysis in
Pisum sativum leaf protoplasts and chloroplasts
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单细胞电感耦合等离子体质谱（SC-ICP-MS）方法被开发用于分析豌豆叶质体和叶绿体的元素异质性，优化了戊二醛固定 protocol 并采用内标校正破碎细胞干扰，发现磷（P）在质体中丰度最高（67.1-135 fg·cell?1），镁（Mg）在叶绿体中丰度最高（33.6-41.5 fg·cell?1），为植物营养分配、金属积累及环境胁迫响应研究提供新工具。
范宇涵|田向伟|徐涛|张庚|张宇格|郭颖颖|刘彦伟|尹永光|刘继燕|蔡勇|姜贵斌
中国科学院大学中丹学院，北京，100190，中国
摘要
由于灵敏度、通量和分辨率的限制，传统技术难以准确捕捉细胞和亚细胞内元素分布的异质性。单细胞电感耦合等离子体质谱（SC-ICP-MS）能够实现单细胞元素的定量分析，但在多细胞植物中的应用仍面临挑战，这主要是由于植物细胞的复杂性以及相关实验方案的缺乏。本研究建立了一种可靠的SC-ICP-MS方法，用于分析Pisum sativum叶片原生质体和叶绿体中的元素异质性。我们采用优化的固定方案：原生质体用1%（v/v）戊二醛固定15分钟，叶绿体用2.5%（v/v）戊二醛固定30分钟，以保持其结构完整性；同时选择P和Mg作为原生质体和叶绿体的特异性指示元素。为减少破碎细胞带来的干扰，在数据处理过程中采用了信号校正方法。经过分离、纯化和戊二醛固定后，对Pisum sativum叶片的原生质体和叶绿体进行了SC-ICP-MS分析。定量分析结果显示，原生质体中P元素最丰富（67.1-135 fg细胞^-1），叶绿体中Mg元素最丰富（33.6-41.5 fg细胞^-1）。该技术推动了植物单细胞元素分析的发展，为了解营养素分布、金属积累以及细胞对环境压力的响应提供了新的见解。
引言
由于复杂的代谢过程、生理功能和运输机制，植物中元素的分布在不同组织、细胞和亚细胞区室之间存在高度异质性[1,2,3]。这种空间异质性对于理解植物如何获取营养、解毒金属以及参与生物地球化学循环至关重要[4]。虽然植物既吸收必需营养素（如N、P、K、Fe、Zn），也吸收非必需的有毒元素（如Hg、Cd、As），但在细胞和亚细胞水平上精确绘制这些元素的分布图仍然是一个重大挑战[5,6]。
为了研究元素的空间异质性，人们采用了多种分析方法，每种方法都有其优势和局限性。传统的批量分析方法包括组织消化和后续的仪器检测，具有较高的灵敏度和多元素定量能力[7]，但其主要缺点是完全丢失了空间信息，无法分辨细胞或亚细胞间的异质性[8]。此外，还开发了一系列元素成像技术，能够在原位实现高分辨率（通常为5-0.015 μm）的成像[9]。尽管这些方法能够保留空间信息，但常受到半定量分析、相对较高的检测限和低通量等限制[10,11]。例如，扫描电子显微镜结合能量分散X射线光谱（EDS）、透射电子显微镜结合EDS（检测限为1000 mg kg^-1）[9,12]、实验室X射线荧光显微镜（XFM，检测限为100 mg kg^-1）以及微粒诱导X射线发射（检测限为1-10 mg kg^-1）等方法，都受到较高检测限的制约[9]。激光烧蚀电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）虽然具有高灵敏度（检测限低至1 mg kg^-1），但其破坏性烧蚀过程可能导致金属重新分布和样品变形[9,13]。基于同步辐射的XFM和纳米级二次离子质谱技术虽然灵敏度很高（约1 mg kg^-1），但由于操作要求复杂且设备昂贵而难以广泛应用[14,15]。因此，亟需一种结合高灵敏度、定量能力和高空间分辨率的技术。
单细胞ICP-MS（SC-ICP-MS）作为一种强大的技术，在细胞水平上实现了元素的定量分析。它兼具高灵敏度（检测限低至0.01 fg细胞^-1）和高通量（典型时间分辨率为0.1-10 ms），同时能够分辨细胞间的异质性，从而高效分析大量细胞[16,17,18]。因此，SC-ICP-MS已被广泛应用于多种细胞类型的研究，包括细菌[19]、酵母[20]、哺乳动物细胞[21]和单细胞藻类[22]，以研究内源性元素以及外源营养素和毒素的吸收情况。然而，其在多细胞植物中的应用仍较为有限。植物细胞结构复杂，具有坚硬的细胞壁和多样的细胞器，给单细胞元素分析带来了很大挑战。通过改进SC-ICP-MS方法以适应植物系统的需求，有望克服这一方法学障碍，为理解植物生理、营养调节和对有毒金属的响应提供新的见解。
本研究旨在建立一种利用SC-ICP-MS分析多细胞植物中细胞和亚细胞元素的方法。选择Pisum sativum作为模型植物，这种广泛种植的豆科作物具有较大的细胞体积和明确的生理特性[23]。通过使用分离得到的叶片原生质体和叶绿体，我们旨在实现细胞和亚细胞水平上元素的可靠定量。该方法将为研究高等植物的细胞和亚细胞过程（如金属稳态、微量营养素动态及对压力的适应性响应）奠定基础。
化学试剂与材料
多元素标准溶液和内标溶液购自Agilent Technologies（加州圣克拉拉）。P标准溶液购自中国北京有色金属与电子材料分析检测中心。40纳米的Au纳米颗粒购自STREM（马萨诸塞州纽伯里波特）。用于制备Au标准溶液的HAuCl4·3H2O（99.99%）购自Alfa Aesar（天津）。用于细胞固定的50%（v/v）戊二醛也来自该公司。
叶片原生质体和叶绿体的分离、纯化与表征
为了提高P. sativum叶片原生质体和叶绿体的质量，我们采用蔗糖密度梯度离心法进行纯化。该方法根据它们的浮力密度分离完整的原生质体和叶绿体，从而减少来自受损细胞的元素泄漏[36,37]以及可溶性蛋白质、其他细胞器和细胞碎片的污染[38]。这一过程显著提高了样品的完整性。
结论
本研究建立了一种可靠的SC-ICP-MS方法，用于P. sativum叶片原生质体和叶绿体的单细胞元素分析。通过优化预处理流程（包括分离、纯化、固定（原生质体用1%戊二醛固定15分钟，叶绿体用2.5%戊二醛固定30分钟）及洗涤步骤），在保持结构完整性的同时最小化了元素损失和干扰。在SC-ICP-MS分析过程中，样品密度设定为1 × 10^5细胞/mL。结果表明，P和Mg是叶片原生质体和叶绿体中含量最丰富的元素。
作者贡献声明
范宇涵：撰写初稿、开展实验、进行数据分析。田向伟：确定实验方法、管理数据。徐涛：验证实验结果、制定实验方法。张庚：验证实验结果、制定实验方法。张宇格：制定实验方法。郭颖颖：制定实验方法。刘彦伟：撰写文本、审稿与编辑、监督研究、协调资源、争取资金支持、提出研究思路。尹永光：撰写文本、审稿与编辑、监督研究、协调资源、争取资金支持。刘继燕：协调资源、争取资金支持。
利益冲突声明
作者声明不存在可能影响本文研究的已知财务利益或个人关系。
致谢
感谢国家自然科学基金（项目编号：42394093、22425606、22376209）以及中国科学院的战略重点研究计划（项目编号：XDB0750200）的财政支持。
