关于两种新型非AOA（硝化球菌属）——Acidarchaeum fankouense和Thermosulfuris yongpingense在酸性矿山排水生态系统中的适应性与微进化过程的基因组学研究

《Systematic and Applied Microbiology》：Genomic insights into adaptation and microevolution of two novel non-AOA Nitrososphaeria, Acidarchaeum fankouense and Thermosulfuris yongpingense, in acid mine drainage ecosystems

本研究在AMD环境中鉴定了44个非AOA Nitrososphaeria基因组组装（MAGs），揭示其代谢适应与进化动力，发现新属Acidarchaeum和Thermosulfuris，并解析其生态适应机制及演化规律。

　　

作者：常立超、苏希凯、胡文哲、方云、刘俊、李金田、黄丽楠、舒文生

中国华中农业大学资源与环境学院农业微生物国家重点实验室，武汉430070

摘要

Nitrososphaeria类群最著名的成员是氨氧化古菌（AOA），然而其深分支的非AOA谱系仍知之甚少，这在我们理解该类群的早期进化及生态多样性方面存在重大空白。本研究从多种金属矿山的酸性矿井排水（AMD）沉积物中恢复了44个非AOA Nitrososphaeria宏基因组组装基因组（MAGs），其中包括属于Thermosulfuridaceae科的两个新属：Acidarchaeum和Thermosulfuris。对全球251个AMD相关宏基因组的分析表明，这些可能具有嗜热性的谱系仅在中国被发现，并且在少数地点（尤其是凡口铅锌矿）出现过局部爆发（占比高达约7.65%）。代谢重建显示它们具有兼性厌氧、混合营养的生活方式，能够进行二氧化碳氧化和硫还原，其广泛的耐酸性和耐重金属能力主要通过醚键连接的古菌脂质、离子外排系统及酶促还原机制实现。Thermosulfuris属具有异化硫酸盐还原能力，而Acidarchaeum属则能利用尿素，这些特征揭示了它们不同的生态位。群体基因组分析显示这些非AOA谱系中同源重组频率较低，存在普遍的纯化选择现象，同时某些地区的选择压力有所减弱，多样性增加；前者与地球化学压力因素（尤其是铜）相关，表明它们经历了长期的地球化学驱动的适应过程。总体而言，这些发现为非AOA Nitrososphaeria的生物多样性、生态生理学和进化动态提供了新的见解。

引言

Nitrososphaeria类群（曾被称为Thaumarchaeota）包含在全球氮循环中起关键作用的古菌，尤其是氨氧化古菌（AOA），它们催化了硝化作用中的限速步骤（Francis等人，2005年）。然而，该类群中的一些深分支谱系缺乏典型的氨氧化机制（Lin等人，2015年），这表明这一代谢特征是后来获得的。最近的研究表明，这一获得事件发生在约23亿年前的大氧化事件期间或之后（Ren等人，2019年）。因此，这些非AOA谱系为我们了解Nitrososphaeria的早期代谢多样化和进化轨迹提供了宝贵的窗口。

许多非AOA Nitrososphaeria成员已在多种生境中被发现，包括海洋环境（Reji和Francis，2020年）、温泉（Hua等人，2018年）、酸性土壤（Weber等人，2015年）以及含水层沉积物（Anantharaman等人，2016年），但对其了解仍然有限。迄今为止，只有单个非AOA菌株Conexivisphaera calidus NAS-02从酸性温泉中分离出来；它是一种严格厌氧、耐热且嗜酸的古菌，能够进行硫和铁的还原（Kato等人，2019年）。比较基因组和系统基因组研究表明Nitrososphaeria具有复杂的进化历史，包括从非AOA向AOA谱系的转变，以及通过横向基因转移（LGT）、基因丢失和基因复制（Aylward和Santoro，2020年；Luo等人，2024年；Ren等人，2019年；Sheridan等人，2020年）实现的厌氧和有氧呼吸方式的转换。尽管已出现广泛的分类模式，但非AOA Nitrososphaeria群体内部的微观多样性和群体水平的进化过程仍大部分未被探索。

酸性矿井排水生态系统具有低pH值和高浓度的重金属及硫酸盐（Baker和Banfield，2003年）。由于这些环境模拟了早期地球的条件（Havig等人，2017年），AMD生态系统成为研究微生物对极端选择压力适应性的天然实验室，并为了解古代代谢和进化过程提供了重要线索。最近的宏基因组调查显示AMD生境中存在许多先前未描述的古菌谱系，包括Nitrososphaeria的非AOA成员（Luo等人，2024年）。重要的是，研究表明pH值是Nitrososphaeria生态位特化和进化多样化的关键驱动因素（Gubry-Rangin等人，2011年；Gubry-Rangin等人，2015年；Luo等人，2024年）。鉴于AMD环境的强酸性，其中的非AOA Nitrososphaeria可能代表了早期分化谱系与现代AOA之间的进化联系。因此，AMD生态系统为将基因组潜力与极端环境限制联系起来、揭示非AOA Nitrososphaeria的适应策略提供了独特的机会。

本研究应用基因组解析宏基因组学和大规模比较分析方法，研究了AMD生境中的非AOA Nitrososphaeria》。我们恢复了44个MAGs，并调查了它们在全球251个AMD宏基因组中的分布情况。代谢重建揭示了这些古菌在极端条件下的生存策略，群体基因组分析揭示了塑造它们的微进化力量。总体而言，这项工作完善了对研究不足的非AOA Nitrososphaeria>的分类，强调了它们适应极端环境的代谢多样性，并阐明了其进化动态。

UBA164家族在AMD沉积物中的基因组发现和系统发育

从17个AMD沉积物样本中恢复了44个属于UBA164家族（Conexivisphaerales目，Nitrososphaeria类）的MAGs，其中11个来自铅锌矿，5个来自铜矿，1个来自黄铁矿-铜矿（表S1和S2）。根据当前的基因组评估标准，其中12个MAGs质量较高，其余质量中等（Bowers等人，2017年）。我们的平均核苷酸同一性（ANI）分析确定了三个物种水平的代表基因组。

讨论

氨氧化Nitrososphaeria在氮循环中起着关键作用（Francis等人，2005年），但其深分支的非AOA谱系仍知之甚少。本研究从AMD生境中恢复了3个高质量的Thermosulfuridaceae MAGs，这些环境再现了早期地球的地球化学特征（Havig等人，2017年），并提出了两个新属：Acidarchaeum和ThermosulfurisNitrososphaeria的系统发育范围，并提供了

结论

总体而言，本研究从AMD生态系统中恢复了44个非AOA Nitrososphaeria MAGs，确定了两个新属：Acidarchaeum和Thermosulfuris，它们都属于Thermosulfuridaceae科。这些古菌仅在中国AMD生态系统中被发现，且在部分沉积物中存在局部爆发现象。代谢重建表明它们具有兼性厌氧、混合营养的生活方式，各属的特异性适应特征表明了它们不同的生态位。这两个属都具有广泛的

数据集获取

2016年至2018年间，从六个不同地点收集了共34个AMD环境样本，包括AMD液体和沉积物（表S3）。采样、DNA提取、宏基因组测序和地球化学分析均按照既定方法进行（Tan等人，2019年）。每个样本大约使用了50升酸性和10克沉积物进行DNA提取。提取的DNA在Illumina HiSeq或MiSeq平台上进行了纯化和测序。pH值使用

CRediT作者贡献声明

常立超：撰写——原始草稿、可视化、研究、正式分析。苏希凯：撰写——审阅与编辑、研究。胡文哲：可视化、研究。方云：撰写——审阅与编辑、监督、资金获取。刘俊：撰写——审阅与编辑、监督、项目管理、资金获取、概念构思。李金田：撰写——审阅与编辑、资源协调。黄丽楠：撰写——审阅与编辑、研究。舒文生：撰写——

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（编号42377114、42577235、42177178和42077281）和华中农业大学科技创新基金（编号2662025ZHPY006）的支持。我们感谢瑞士弗里堡大学的Heinz Müller-Sch?rer教授和中国华中农业大学的Sun Yan教授在统计分析方面的帮助。