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线粒体粘度荧光探针设计及其在肿瘤动态监测中的应用。
Fan Wang|Zhiyu Wang|Kun Yu|Yuqing Wang|Qi Su|Chunxv Han|Wenxuan Hu|Lei Hu|Ping Li|Hui Wang
中国芜湖皖南医学院代谢性疾病药物基础研究创新中心，241002
摘要
线粒体粘度的异常与肿瘤的发生和发展密切相关。因此，开发能够实时、精确监测肿瘤细胞中线粒体粘度变化的荧光探针对于肿瘤的早期诊断和治疗评估具有重大潜力。本研究设计并合成了一系列基于吩噻嗪-联噻吩-吡啶结构的近红外（NIR）荧光探针（W1–W3）。这三种探针（W1–W3）的发射波长约为650纳米，并伴有约150纳米的显著斯托克斯位移。其中，W2和W3对粘度的变化表现出优异的响应性。它们的分子旋转特性使得在低粘度环境中荧光减弱，在高粘度介质中荧光增强，从而能够高度敏感地检测粘度变化。细胞实验表明，W2具有出色的生物相容性和精确的线粒体靶向能力。值得注意的是，其在低至500纳摩的浓度下就能实现有效的生物成像。该探针还能动态监测药物诱导（例如DXM、罗丹明）的线粒体功能障碍过程中的粘度变化。值得注意的是，W2能够检测到由凋亡诱导剂（例如DOX、顺铂）触发的肿瘤细胞中线粒体粘度的增加，从而证实了其追踪线粒体粘度动态变化的能力。体内和体外成像结果证实了探针W2在肿瘤成像中的潜力。凭借其从细胞到体内水平动态监测粘度的能力，探针W2成为推进早期肿瘤诊断、药物疗效评估和精准治疗应用的有希望的工具。
引言
恶性肿瘤是一个重大的全球公共卫生挑战，其特征是多基因和多阶段的病理过程。据2022年全球统计数据显示，每年约有2000万新病例和近1000万人因此死亡，癌症带来了巨大且不断增长的疾病负担。更令人担忧的是，预计到2050年全球发病率将增加77%，达到约3500万新病例，给全球公共卫生系统带来前所未有的挑战[1,2]。要应对这一日益严重的负担，需要在微观层面对癌症生物学有更深入的了解。肿瘤微环境（TME）以其高度异质性和动态性而著称，在疾病进展和治疗反应中起着关键作用[3]。在TME中，酸中毒、缺氧和代谢重编程等机制直接重塑了细胞内环境并改变了细胞器的功能。值得注意的是，线粒体作为能量代谢和凋亡的核心调节器，会在线粒体微环境的信号下发生显著的功能和结构变化，包括粘度和极性的变化[[4], [5], [6]]。
作为细胞的能量中心，线粒体通过氧化磷酸化合成ATP来为细胞活动提供能量并调节代谢[7]。异常的线粒体粘度会阻碍代谢物的扩散和能量产生的效率，导致活性氧（ROS）的积累、线粒体功能障碍，甚至细胞凋亡[8]。目前用于检测线粒体粘度的方法（如流式细胞术和透射电子显微镜（TEM）受到操作复杂性、侵入性和无法进行实时动态监测的限制，这限制了它们在肿瘤研究中的应用[9]。相比之下，荧光探针具有高时空分辨率、特异性和实时监测能力，适用于线粒体粘度的检测。近红外（NIR）荧光探针具有特别的优势，因为它们光损伤小、组织穿透深度深、背景干扰低，非常适合用于肿瘤中线粒体粘度的动态检测[10,11]。这些响应粘度的探针通常通过扭曲的分子内电荷转移（TICT）机制发挥作用：分子旋转的运动受到局部粘度增加的抑制，从而抑制非辐射跃迁并增强荧光发射[12]。此外，具有较大斯托克斯位移的探针能有效分离激发光谱和发射光谱，显著减少自体荧光干扰，提高复杂生物系统中的信噪比和灵敏度[13,14]。近年来，在开发用于检测线粒体粘度的荧光探针方面取得了显著进展[[15], [16], [17]]。然而，一些现有探针仍存在缺点，如合成路线复杂、发射波长短、斯托克斯位移小以及适用于体内成像的能力有限。因此，开发一种具有较大斯托克斯位移的NIR荧光探针，以实现对活体肿瘤中线粒体粘度的高度敏感和特异性监测具有重要意义。
在这项研究中，使用吩噻嗪和联噻吩作为电子供体（D），吡啶盐作为电子受体（A），以及联噻吩和C
C双键作为π共轭桥，合成了三种D-π-A结构的NIR荧光探针（
W1–W3）（图1和图S1）。这种结构具有以下优势：（1）吩噻嗪单元具有强的电子供体能力和非平面的“蝴蝶”构象，不仅促进了分子内电荷转移（ICT），导致吸收和发射光谱的红移，还通过空间位阻抑制了π-π堆叠，有效减轻了聚集引起的荧光淬灭（ACQ）[18,19]。（2）联噻吩单元既充当π桥，又作为辅助电子供体。其扩展的共轭框架促进了电子离域，增强了ICT效应，共同导致了显著的光谱红移[20,21]。（3）吡啶盐作为强电子抽取基团，显著增强了ICT效应，并推动了显著的光谱红移。吡啶阳离子通过静电吸引实现线粒体靶向，而烷基侧链通过疏水相互作用增强了定位稳定性，共同确保了探针在线粒体内的精确积累[22]。（4）研究了不同烷基侧链结构对探针光物理性质的影响。光学表征显示，所有三种探针都在近红外区域（约650纳米）发射，并具有较大的斯托克斯位移（约150纳米）。其中，
W2和
W3在粘度增加时表现出显著的荧光增强，且其荧光强度不受溶剂极性或其他分析物的影响。共定位实验证实了
W2和
W3的有效线粒体靶向性。随后的成像显示，
W2即使在低浓度（500纳摩）下也能清晰地显示线粒体。此外，一系列药物诱导实验表明，
W2能够有效监测细胞水平上的线粒体粘度变化，并评估药物治疗的效果。最后，探针
W2在体外和体内肿瘤模型中均成功实现了成像，证明了其在精确监测生物各个层次肿瘤微环境变化中的实用性。
结果与讨论
为了系统研究探针W1–W3的光物理性质，我们首先在一致的溶剂环境（DMSO）中记录了它们的紫外-可见光吸收光谱。如图1A所示，所有三种探针的吸收最大值都在约500纳米，表明侧链长度的结构修饰对它们的吸收特性影响很小。我们进一步评估了它们在不同极性溶剂（包括乙醇）中的吸收行为
结论
本研究成功设计并合成了一系列基于吩噻嗪-联噻吩-吡啶结构的NIR荧光探针W1–W3，这些探针的吡啶N原子上带有不同的烷基侧链。光物理研究表明，烷基链对吸收特性的影响很小，但显著调节了探针对粘度的响应。其中，探针W2在高粘度环境中表现出显著的“开启”荧光响应
材料与设备
所有化学试剂均从上海Aladdin的供应商处购买，无需进一步纯化。1H NMR光谱是在Bruker 400光谱仪上记录的。光谱仪的紫外-可见光光谱是在UV-5900 PC UV-VIS分光光度计上获得的。荧光光谱是用Hitachi F-4600荧光分光光度计测量的（探针W1：λex = 485纳米；狭缝宽度10, 10；电压500伏；探针W2：λex = 485纳米；狭缝宽度10, 10；电压500伏；探针W3：λex = 485纳米；
CRediT作者贡献声明
Fan Wang：正式分析、研究、方法学、资源、软件、监督、撰写——原始草稿。Zhiyu Wang：正式分析、研究、方法学、资源、软件、监督。Kun Yu：方法学、资源、软件、监督。Yuqing Wang：正式分析、研究、资源。Qi Su：方法学、资源。Chunxv Han：研究、方法学。Wenxuan Hu：研究、方法学。Lei Hu：概念构思、资金获取、方法学、项目
致谢
本工作得到了国家自然科学基金（22575177）、安徽省高等教育机构自然科学基金重点计划（2023AH051762, 2023AH051747）的资助，以及皖南医学院的学术和技术领导候选人支持。
