甘氨酸通过AMPK-mTORC1途径调节猪卵母细胞在体外对营养物质的感知

体外成熟中低葡萄糖应激导致猪卵母细胞线粒体钙超载、ATP耗竭及氧化应激，甘氨酸通过激活AMPK和抑制mTORC1恢复能量代谢平衡，同时提升eIF4E翻译活性并纠正H3K27me3/H3K36me3表观遗传修饰，实现营养补偿。

　　

宁旭|冉腾|陈兴福|邢玉宁|孙晓青|袁德鑫|索莉

吉林农业大学，中国长春新城区街道2888号，130118

摘要

卵母细胞的体外成熟（IVM）对于提高畜牧业的繁殖效率至关重要。研究卵母细胞的营养感知机制对于理解调控卵母细胞生长和代谢的调控网络至关重要。本研究旨在阐明猪卵母细胞如何感知甘氨酸的营养作用，从而在低葡萄糖压力下提供营养补偿，以维持体外发育过程中的正常生物功能。我们评估了与卵母细胞成熟、早期胚胎发育、线粒体功能和能量代谢相关的指标，共分为四组：对照组（Con）、低葡萄糖组（LG）、甘氨酸组（Gly）以及低葡萄糖加甘氨酸组（LG + Gly）。研究结果表明，低葡萄糖压力组在卵母细胞和胚胎发育方面均出现了显著损伤，这与活性氧（ROS）的过度积累、三磷酸腺苷（ATP）水平显著下降以及线粒体中Ca²⁺的显著积累和线粒体功能受损有关。对参与能量代谢的关键信号通路AMPK-mTORC1的分析显示，低葡萄糖压力导致AMPK过度激活和mTORC1抑制。甘氨酸补充使AMPK和mTORC1的活性恢复到与对照组相当的水平，显著减少了ROS的产生，增加了ATP含量，并显著上调了PGC-1和RHEB的mRNA表达，表明线粒体功能恢复正常并发生了“营养补偿”。这些发现表明，甘氨酸可以缓解低葡萄糖压力引起的能量代谢途径失衡。此外，在蛋白质和转录水平上检测到eIF4E的表达增加，进一步证实了甘氨酸的作用。结果还显示H3K27me3的表达受到抑制，而H3K36me3的表达得到激活，这进一步说明了胚胎发育的改善。总之，甘氨酸通过调节AMPK和mTORC1为卵母细胞的体外成熟（IVM）和早期胚胎发育提供了额外的能量。这种调节机制缓解了低葡萄糖压力引起的线粒体功能下降、能量供应不足以及卵母细胞向胚胎转变异常的问题。本研究为卵母细胞营养感知理论的发展奠定了基础。

引言

卵母细胞的体外成熟（IVM）技术对于现代畜牧业的优良种子繁殖、稀有种质资源的保存以及胚胎生物技术的进步至关重要[1]。成熟卵母细胞的质量直接关系到其受精能力和随后的胚胎发育能力，最终影响新生个体的终生命运[2]。与体内成熟的卵母细胞相比，体外培养的卵母细胞脱离了卵泡内的微环境，因此经常会出现细胞质成熟不足的问题，包括线粒体功能障碍、内质网应激[3]和由于营养感知失调及代谢压力导致的错误表观遗传修饰[4]。这种情况导致卵母细胞成熟质量下降和胚胎发育潜力降低[5]。因此，阐明卵母细胞在体外的营养感知机制并重建一个模拟体内条件的营养微环境对于克服IVM技术相关挑战至关重要。

氨基酸是细胞生长和发育的重要能量来源，不仅作为蛋白质合成的底物，还充当信号分子、抗氧化剂和能量来源[3]。其中，甘氨酸是最简单的非必需氨基酸，在女性生殖道的液体中浓度最高，包括输卵管、子宫和卵泡液[6]。此外，在哺乳动物卵母细胞从胚泡（GV）阶段到第二次减数分裂的中期（MII）的成熟过程中，甘氨酸的代谢活性逐渐增加，这表明甘氨酸在卵母细胞成熟过程中具有特定的需求[7]。然而，在配子的体外生产（IVP）过程中，由于外部微环境的变化，甘氨酸的内源性供应不足，导致“功能缺陷”，限制了卵母细胞的发育潜力。我们之前的研究表明，外源性甘氨酸补充可以显著改善线粒体功能并促进猪卵母细胞核和细胞的同步成熟[8]。尽管如此，卵母细胞如何感知甘氨酸以发挥其生物学功能的具体机制仍不清楚。

营养感知在调节细胞代谢中起着关键作用，使生物体能够检测环境或细胞内营养水平的波动，并据此调整其代谢过程[9]。这一复杂机制涉及通过复杂的分子网络监测细胞外和细胞内的营养可用性和能量状态。在这个网络中，AMPK和mTORC1作为两个基本的调控枢纽，建立了细胞代谢中的“阴阳”平衡[10,11]。作为“能量传感器”，AMPK在葡萄糖缺乏和能量不足时被激活，其特征是AMP/ATP比率升高。它促进分解代谢过程，如脂肪酸氧化、糖酵解和自噬以产生ATP，同时抑制蛋白质和脂质合成等能量密集型过程[12]。相反，mTORC1作为“营养和生长传感器”，对氨基酸和生长因子作出反应；其激活促进蛋白质合成和核糖体生物发生，从而支持细胞生长和发育[13]。

研究表明，AMPK通过磷酸化TSC2和Raptor直接抑制mTORC1，从而在能量不足的情况下阻止耗能的生长[14]。其他研究显示，AMPK激活通过TSC2磷酸化增强TSC复合体的GAP活性，促使RHEB从GTP结合（活性）形式转化为GDP结合（非活性）形式。非活性的RHEB无法激活mTOR，从而间接阻碍了RHEB对mTOR的正向调控信号。此外，线粒体可以通过调节内部谷胱甘肽（GSH）水平自主感知抗氧化需求[15]。这些机制共同构成了一个复杂的营养感知网络[16]。

营养感知对胚胎发育的调控主要通过精确控制翻译过程来实现。在营养充足的情况下，mTOR磷酸化4E-BP1，使其与eIF4E分离。释放的eIF4E启动依赖帽结构的翻译，有效合成对细胞增殖和分化至关重要的蛋白质，如PRC2和SET2家族激酶，为胚胎发育提供关键的物质基础[17]。相反，在营养缺乏的情况下，AMPK通路被激活，eIF4E的激活受到RHEB-mTOR信号通路的抑制。这导致4E-BP1持续与eIF4E结合，从而降低整体翻译效率，减少非必需蛋白质的合成，同时优先表达核心发育基因[18]。同时，H3K27me3和H3K36me3通过表观遗传重编程协同调节基因表达，进一步确保胚胎发育的有序进行。在关键发育阶段，H3K27me3通过其抑制作用精确调节重要发育基因的时空表达，维持基因组印记的稳定性和亲本来源特异性的基因表达，为正常的胚胎着床和发育奠定基础[19]。相反，H3K36me3通过其激活作用提高基因转录的准确性，特别是增强与细胞增殖和分化相关的基因表达[20]。这一机制补充了由营养感知途径调节的蛋白质合成，为发育提供足够的能量和物质支持。此外，它还参与DNA损伤修复和转录保真度的调节，从而降低胚胎发育过程中的基因突变风险[21]。

研究表明，甘氨酸可以影响猪卵母细胞的体外发育，为早期胚胎提供足够的能量，如ATP的产生。我们之前的研究表明，甘氨酸通过IP3R调节Ca²⁺水平，IP3R是线粒体相关内质网膜（MAM）上的一个关键相互作用因子。这种调节在体外压力条件下维持钙的稳态，保护正常的线粒体功能，并最终促进猪卵母细胞的体外发育[22]。这一过程是否与营养感知有关？针对阿尔茨海默病（AD）患者的研究表明，NMDA受体激活诱导的细胞内钙[23]增加以CAMKK2依赖的方式激活AMPK。此外，对神经细胞的研究表明，Ca²⁺信号可以调节AMPK和mTOR之间的相互作用，从而影响细胞存活和代谢平衡[24]。

我们假设甘氨酸在调节Ca²⁺水平方面发挥作用。本研究旨在探讨猪卵母细胞如何感知甘氨酸的营养作用，从而在低葡萄糖压力下提供营养补偿，以维持体外发育过程中的正常生物功能。全面研究卵母细胞的营养感知机制对于阐明调控卵母细胞生长和代谢的调控网络至关重要。通过揭示信号通路、关键调控因子及其在营养感知中的作用，特别是关于氨基酸的作用，这项研究为开发更全面的体外细胞代谢模型奠定了基础。这项努力将有助于我们更好地理解细胞如何检测和响应营养信号以执行特定的生物功能。

材料与方法

所有关于动物护理和使用的程序均遵循《农业动物在研究和教学中的护理和使用指南》。人道安乐死操作按照《中国生猪屠宰条例》中的标准进行。除非另有说明，所有化学品均来自Sigma Chemical Co.（美国密苏里州圣路易斯）。

甘氨酸对猪卵母细胞体外成熟的影响

为了研究甘氨酸在猪卵母细胞体外成熟（IVM）中的调控作用及其在低葡萄糖压力下的潜在缓解效果，将卵丘-卵母细胞复合体（COCs）在四种不同的培养基中培养42小时。如图1AB所示，评估了卵丘细胞的扩张情况。结果表明，对照组和甘氨酸组均表现出完全扩张的卵丘细胞，并具有放射状分布。相比之下，低葡萄糖（LG）组显示

讨论

成熟卵母细胞的质量受到其感知和利用营养能力的影响。尽管甘氨酸被认为可以促进卵母细胞的发育，但其作用的具体机制仍不清楚。本研究阐明了一种新的机制，即甘氨酸通过重新平衡关键的营养感知通路AMPK-mTORC1来保护猪卵母细胞免受低葡萄糖压力的影响。

结论

总之，甘氨酸通过重新平衡关键的营养感知通路AMPK-mTORC1，缓解了低葡萄糖压力引起的线粒体功能障碍、ATP缺乏、ROS升高和胚胎发育异常。

作者贡献声明

宁旭：撰写——原始草案、研究、数据分析。冉腾：撰写——审阅与编辑、监督、数据分析。陈兴福：撰写——审阅与编辑、数据分析。邢玉宁：数据分析。孙晓青：撰写——审阅与编辑、监督。袁德鑫：监督、数据分析。索莉：撰写——审阅与编辑、验证、资源管理、项目协调、资金获取、概念构思。

数据和材料的可用性

本研究生成或分析的所有数据均包含在本文中。

资助

本项目得到了吉林省教育厅科技项目（JJKH20261184KJ）的支持。

利益冲突声明

作者声明没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。