编辑推荐：
非热等离子体（DBD）优化处理可提升公猪精子活力及线粒体功能，通过激活FOXO3-PINK1/Parkin自噬通路实现受损线粒体的清除，从而改善精子质量而不影响DNA和顶膜完整性，为牲畜繁殖提供新策略。
唐瑶|唐云平|王倩|刘江伟|李茵|王丽娟|王毅|王宪忠|张姣姣
中国重庆市西南大学兽医学院饲料与食草动物重点实验室，400715
摘要
公猪精子的质量是生殖成功的关键内在因素，优化其质量对于提高养猪效率至关重要。本研究探讨了非热介质阻挡放电（DBD）等离子体对公猪精子质量的影响及其潜在的调控机制。结果表明，优化后的DBD等离子体提高了公猪精子的存活率和活动力、三磷酸腺苷（ATP）水平、线粒体膜电位以及线粒体呼吸链酶的活性，同时降低了线粒体通透性转换孔的开放程度。转录组测序显示，DBD等离子体处理后精子中的线粒体自噬相关基因发生了显著变化。相应地，包括Forkhead box O3（FOXO3）、PTEN诱导激酶1（PINK1）、Parkin、BCL2相互作用蛋白3（BNIP3）和LC3 II/LC3 I比例在内的线粒体自噬相关蛋白在蛋白质水平上有所增加，而P62和TOM20的蛋白质水平在DBD等离子体处理的精子中降低。线粒体自噬抑制剂Mdivi-1降低了精子的线粒体自噬水平、线粒体功能及精子质量，但这些效应可被DBD等离子体逆转。此外，DBD等离子体增强了FOXO3-PINK1和PINK1-Parkin的结合相互作用。使用siRNA沉默FOXO3、PINK1和Parkin会抑制线粒体自噬水平、线粒体功能及精子质量，但这些效应可被DBD等离子体缓解。这些发现表明，适当的DBD等离子体通过激活FOXO3-PINK1/Parkin介导的线粒体自噬来增强线粒体功能，从而提高公猪精子质量，且不会破坏精子DNA的完整性和顶体的完整性。因此，非热等离子体技术为通过调控靶向线粒体自噬来提高精子质量提供了一种新策略，具有在畜牧业繁殖中应用的巨大潜力。
引言
越来越多的证据表明，全球范围内雄性动物的精液质量呈下降趋势[[1], [2], [3]]。由于猪与人类在生殖结构上的相似性，猪常被用作研究人类精子基础代谢活性的模型[4]。药物残留、重金属污染和热应激等不良因素引起的线粒体功能障碍会导致人类和动物的精液质量下降[5]。精子质量决定了人工授精的成功率，进而影响受孕率和窝产仔数等主要生殖指标[6,7]。线粒体在从精子发生到受精的整个生殖过程中起着关键作用[5]。特别是，最佳的线粒体功能和完整的线粒体膜电位对于确保精子存活率、顶体反应以及维持DNA完整性至关重要[8]。目前农场正通过改善营养标准、加强运动管理和实施合理育种来提高公猪的精液质量[9]，但这些方法需要增加经济成本和劳动力投入。因此，如何通过调节精子线粒体功能有效提高公猪精液质量是一个亟待解决的挑战。
线粒体自噬可以调节线粒体的数量和质量，通过清除受损或功能失调的线粒体来维持线粒体功能[10]。线粒体自噬在许多过程中起着重要作用，包括早期胚胎发育、细胞分化、炎症和凋亡[11]。研究发现，在应激条件下，线粒体自噬可以促进细胞存活并维持功能活性[12,13]；而抑制线粒体自噬会导致线粒体功能障碍，进一步引发凋亡或精子死亡[14,15]。然而，寻找一种有效的方法来靶向线粒体自噬以减轻线粒体损伤并提高精子质量仍具有挑战性。Forkhead box O3（FOXO3）影响哺乳动物精原干细胞的存活和精子发生[16]，并在PTEN诱导激酶1（PINK1）/Parkin介导的线粒体自噬中起重要作用[17]。PINK1/Parkin介导的线粒体自噬是经典的哺乳动物细胞线粒体自噬途径，可选择性清除冗余或受损的线粒体[18]。PINK1作为线粒体自噬的关键调节因子，在稳态条件下会持续降解。在线粒体自噬过程中，PINK1定位于线粒体外膜，激活Parkin和线粒体泛素连接酶，从而诱导泛素介导的线粒体自噬[19,20]。
非热介质阻挡放电（DBD）等离子体技术目前应用于杀菌、创伤修复、组织再生、口腔治疗和癌症治疗[21]，同时也用于畜牧业中的废水处理、疫苗生产和动物食品保存[22]。DBD等离子体能够以强度和时间依赖的方式调节细胞功能和精子存活率。低强度和短期处理可促进猪血管内皮细胞的增殖[23]，而高强度和长期处理则可诱导哺乳动物乳腺上皮细胞的凋亡[24]。我们之前的研究表明，在优化条件下，DBD等离子体减少了公猪精子中的线粒体数量，同时提高了精子的直线前向运动能力[25]。有报道称，高存活率的精子线粒体数量较少，但其线粒体活性较高[26]。然而，DBD等离子体处理的精子中线粒体数量减少后是否仍能通过线粒体自噬提供足够的能量并支持精子活性尚不清楚。因此，本研究旨在探讨非热DBD等离子体对公猪精子线粒体自噬的影响，并探索线粒体自噬在优化DBD等离子体介导的精子质量改善中的潜在机制。
实验部分
公猪精液采集
精液样本来自六头健康的兰德瑞斯公猪（约10个月大，来自重庆合川区德康养猪有限公司，在相同的控制条件下饲养），通过随机抽样方法从每头公猪单独采集精液，不进行混合。采集工作由该公司的技术人员完成，样本立即转移到37°C的水浴中。确认精液质量合格后，对精液进行稀释。
DBD等离子体对公猪精子质量、线粒体功能和线粒体自噬的影响
经过优化处理的DBD等离子体处理后，精子存活率（p<0.01）和活动力（p<0.05）显著提高，而顶体和DNA的完整性没有显著差异（图1A–D）。这表明适当的DBD等离子体可以在不损害顶体和DNA完整性的情况下提高公猪精子质量。此外，结果显示ATP水平及线粒体呼吸链复合体I、II、III、IV和V的酶活性显著增加。
讨论
本研究结果表明，适当的DBD等离子体可以提高公猪精子的存活率和活动力，同时不损害顶体和DNA的完整性。此外，DBD等离子体还增强了精子线粒体功能和线粒体自噬水平。尽管Mdivi-1抑制精子线粒体自噬会导致ATP水平、线粒体膜电位、线粒体呼吸链复合体酶活性以及线粒体通透性转换孔状态的下降，
结论
最佳的DBD等离子体处理通过激活线粒体自噬（可能通过FOXO3-PINK1/Parkin信号通路）提高了公猪精子质量。这种激活作用增强了线粒体功能，进而提高了精子的存活率和活动力。本研究利用非热等离子体调节线粒体自噬，为提高精子质量提供了一种新方法，对畜牧业繁殖具有重大意义。
作者贡献声明
唐瑶：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原稿、验证、方法学、实验设计、数据分析、概念化。唐云平：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原稿、验证、方法学、实验设计、数据分析、概念化。王倩：软件操作、方法学、实验设计、数据分析。刘江伟：验证、方法学、实验设计。李茵：验证、实验设计、数据分析。王丽娟：数据可视化。
伦理批准和参与同意
本研究中涉及动物的所有实验程序均获得了西南大学动物护理和使用委员会的批准（批准编号：IACUC-20220610-01，中国重庆）。
数据可用性声明
支持本研究结果的数据可向通讯作者索取。
资助
本研究得到了国家自然科学基金（32273071）、重庆市自然科学基金（CSTB2024NSCQ-MSX0231）、 Cornell大学基础研究基金（SWU-XDJH202307）以及重庆海外高层次人才创新创业计划（cx2025018）的支持。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
作者感谢重庆合川区德康养猪公司的工作人员在运输前采集公猪精液样本并检测精液质量。
