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体外受精中抗氧化剂MTR-AO（含MitoQ、TUDCA、Resveratrol）显著提升牛胚胎发育率与妊娠率，机制为缓解线粒体氧化损伤、内质网应激及ROS积累，促进卵母细胞红ox平衡。
塞缪尔·格布雷梅德恩（Samuel Gebremedhn）|马塞洛·鲁贝萨（Marcello Rubessa）|凯尔西·洛克哈特（Kelsey Lockhart）|伊万杰琳·纳特拉（Evangeline Natera）|丽贝卡·L·克里舍尔（Rebecca L. Krisher）|保拉·罗德里格斯-维拉米尔（Paula Rodriguez-Villamil）
Genus PLC，美国威斯康星州德福雷斯特（DeForest, WI, USA）
摘要
体外卵母细胞成熟（IVM）是辅助生殖技术（ART）中优化胚胎发育的关键阶段。然而，体外环境常常使卵母细胞暴露于氧化应激和过量的活性氧（ROS）中，从而影响其发育能力。本研究旨在评估一种新型的细胞器特异性抗氧化剂混合物（MTR-AO）的效果，该混合物由线粒体醌（Mitoquinone，0.1 μM）、TUDCA（100 μM）和白藜芦醇（Resveratrol，0.5 μM）组成，以促进牛辅助生殖技术中的卵母细胞和胚胎发育。我们研究了在卵母细胞成熟过程中补充MTR-AO对胚胎发育、存活率、玻璃化后孵化率以及妊娠结果的影响。研究结果表明，MTR-AO显著提高了囊胚的产量和质量，具体表现为第7天（32.7 ± 3.7 vs 40.1 ± 1.7）和第8天（41.8 ± 4.3 vs 47.4 ± 1.9）的囊胚数量增加。同样，第7天（18.8 ± 2.1 vs 26.5 ± 2.3）和第8天（23.6 ± 1.8 vs 35.7 ± 1.3）的1级和2级囊胚比例也显著提高。此外，MTR-AO补充组中玻璃化胚胎在解冻后24小时的孵化率也有所提高（59.0 ± 7.6 vs 86.3 ± 6.1）。观察到一个间接指标，表明卵母细胞的抗氧化能力得到增强，因为用过的卵母细胞成熟培养基中的还原型谷胱甘肽（GSH）浓度显著增加。基因表达分析显示，氧化应激、内质网（ER）应激和凋亡相关基因的水平显著下降，表明细胞应激减轻。胚胎移植数据显示，使用MTR-AO处理的卵母细胞产生的胚胎移植后的妊娠率提高了约5%。这些发现突显了MTR-AO混合物在减轻氧化应激和内质网应激方面的有效性，从而提高了卵母细胞及其后续胚胎的质量。这项研究强调了细胞器特异性多抗氧化剂补充方法在改善ART结果方面的潜力，为优化商业牛胚胎生产策略及其他动物和人类的生殖技术提供了有价值的策略。
引言
在农场动物的辅助生殖技术（ART）中，体外卵母细胞成熟（IVM）是体外胚胎生产（IVP）过程中的第一个也是最关键的阶段。在此阶段，卵母细胞经历核和细胞质的成熟，并获得支持进一步胚胎发育的能力[1]。与体内胚胎相比，体外产生的牛胚胎发育能力下降，这归因于IVM过程中卵母细胞暴露于各种细胞应激因素[2]。多个因素，包括卵母细胞的固有质量和培养条件[4]，会影响IVM的成功以及IVF后的胚胎发育[3]。
在牛的IVM过程中，通常在5%二氧化碳（CO2）和大气氧（O2）水平的培养箱中进行，这些条件远高于卵巢卵泡内的O2含量[5]。此外，IVM培养基常用于将卵母细胞从卵巢采集或卵子取卵（OPU）站点运输到实验室，在此过程中卵母细胞暴露于较高的O2环境中，这会引发过量的ROS生成，导致卵母细胞及其周围细胞的细胞损伤，从而影响其发育能力，并导致胚胎丢失[6]。
在正常的生理条件下，产生适量的ROS对多种细胞功能是必要的。然而，过量的ROS会产生细胞功能障碍和细胞活力下降[7]，从而导致氧化应激。细胞损伤的程度取决于自由基的产生与细胞清除这些自由基的能力之间的平衡。一种减少卵母细胞成熟过程中过量ROS不良影响的策略是向IVM培养基中外源性补充多种已被证明具有有益效果的抗氧化剂[8]。
白藜芦醇（3,5,4′-三羟基-反式-stilbene）是一种存在于多种植物中的多酚化合物，也是最常用的抗氧化剂之一。白藜芦醇以SIRT1依赖的方式改善线粒体功能并维持细胞稳态[9]。据报道，将白藜芦醇添加到卵母细胞成熟培养基中可以减少ROS的积累，提高囊胚率，并增加囊胚的总细胞数[10]。同样，白藜芦醇还能通过改善线粒体清除能力和减少囊胚细胞的线粒体拷贝数来促进冷冻胚胎的解冻后发育，而不影响ATP水平[11]。这使得白藜芦醇成为一种有吸引力的抗氧化剂选择，因为它在牛的ART程序中具有广泛的积极作用。
线粒体健康对多种细胞功能至关重要。它们主要作为细胞应激的传感器，尤其是氧化应激[12]。据报道，卵母细胞中的线粒体损伤会对胚胎产生负面影响。有趣的是，来自缺乏通过线粒体自噬进行受损线粒体生物发生和清除机制的卵母细胞的胚胎表现出较低的线粒体潜力和较低的ATP生成代谢物[13]。即使胚胎培养条件是无脂肪酸的，来自无脂肪酸暴露卵母细胞的牛胚胎也表现出较高的ROS生成、较低的发育率和线粒体功能的持续改变[14]。这表明，在成熟阶段保护卵母细胞免受ROS引起的应激对于获得更好的胚胎发育结果至关重要。线粒体醌（MitoQ）是一种常用的靶向线粒体的抗氧化剂，其在线粒体基质中的积累能力较强[16]。研究表明，牛卵母细胞暴露于棕榈酸会导致氧化应激并阻碍胚胎发育。有趣的是，补充MitoQ可以防止线粒体和氧化应激损伤，提高囊胚率[17]。将MitoQ添加到小鼠IVM培养基中可以促进受精和囊胚率。此外，MitoQ补充还能增加GSH含量和线粒体膜电位，并降低细胞内ROS浓度[18]。
内质网（ER）是调节蛋白质折叠的重要细胞器[19]。多种应激因素，包括ROS，会破坏ER微环境，引发ER应激，导致蛋白质错误折叠和在ER腔内积聚[20]。同样，ER应激还会导致线粒体ROS的过量产生，从而激活凋亡途径[21]。牛尿石胆酸（TUDCA）是一种ER应激抑制剂，已被用于缓解体外成熟和胚胎发育过程中的ROS诱导的应激[22,23]。在胚胎培养基中补充TUDCA可以提高克隆牛胚胎的发育能力[24]，并减轻在高O2压力下培养的胚胎的应激[25]。
迄今为止，已有报道称多种抗氧化剂在卵母细胞成熟和胚胎发育过程中具有有益效果（参见参考文献[26]）。然而，不同抗氧化剂的生化特性和作用机制的差异使得几乎不可能选择一种适用于所有培养条件和实验室环境的单一抗氧化剂。因此，深入研究其作用机制和ROS的亚细胞来源是非常重要的。
在这里，我们旨在开发一种能够针对上述不同细胞来源的ROS的细胞器特异性抗氧化剂混合物。选择这些单独的抗氧化剂时考虑了它们与卵母细胞成熟相关的细胞器特异性作用机制。该混合物的每个组分单独补充时都已被证明能支持IVP。我们开发的抗氧化剂混合物含有0.1 μM的MitoQ、100 μM的TUDCA和0.5 μM的白藜芦醇，命名为MTR-AO。我们在卵母细胞成熟培养基中补充了MTR-AO。在体外受精、体外胚胎发育和孵化后，评估了还原型GSH的生成以及关键应激相关基因的表达。此外，还评估了MTR-AO补充对OPU来源的卵母细胞、其胚胎生产和后续妊娠率的影响。
部分摘要
化学物质和试剂
除非特别说明，所有化学物质和试剂均购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯（St. Louis, MO））。
抗氧化剂混合物的配制
抗氧化剂混合物的各个组分（MitoQ、TUDCA和白藜芦醇）的储备溶液分别溶解在适当的溶剂中：乙醇、水和DMSO中。通过将储备溶液稀释到IVM培养基中（参考文献[27]修改），制备了各个抗氧化剂的工作溶液，最终浓度分别为0.1 μM的MitoQ和100 μM的TUDCA。
在卵母细胞成熟过程中补充MTR-AO可提高囊胚的产量和质量
我们研究了在卵母细胞成熟培养基中补充MTR-AO对后续卵裂和囊胚发育的影响。共有1047个卵母细胞被分配到两个处理组。第4天，MTR-AO补充对胚胎卵裂没有显著影响（p = 0.14）（表2）。然而，补充后第7天的总囊胚发育显著增加（P = 0.04），1级和2级囊胚的比例也有所增加
讨论
本研究结果表明，在牛卵母细胞成熟培养基中补充细胞器特异性MTR-AO混合物显著改善了体外胚胎生产过程的多个结果，包括总囊胚数量、1级和2级囊胚的发育情况以及玻璃化后的孵化率，这归因于用过的培养基中还原型GSH含量的增加和应激相关基因转录本的下调。此外，在卵母细胞成熟培养基中补充MTR-AO
结论
总之，将包含MitoQ、白藜芦醇和TUDCA的细胞器特异性AO混合物加入牛卵母细胞成熟培养基中，显著增强了卵母细胞的发育能力并改善了后续胚胎的发育。这可能是由于AO混合物中的组分在减轻线粒体功能障碍、缓解ER应激以及减少过量细胞质ROS方面发挥了潜在作用，从而促进了细胞氧化还原平衡
CRediT作者贡献声明
塞缪尔·格布雷梅德恩（Samuel Gebremedhn）：撰写 – 原始草稿、可视化、方法学、研究、数据分析、概念化。马塞洛·鲁贝萨（Marcello Rubessa）：撰写 – 审稿与编辑、监督、资源管理、项目协调。凯尔西·洛克哈特（Kelsey Lockhart）：撰写 – 审稿与编辑、验证、方法学、研究、数据管理。伊万杰琳·纳特拉（Evangeline Natera）：撰写 – 审稿与编辑、资源管理、研究。丽贝卡·L·克里舍尔（Rebecca L. Krisher）：撰写 – 审稿与编辑、监督、资源管理、项目协调。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
