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本研究比较了牦牛体外培养至第5、6、7天胚胎的发育潜力和妊娠结果，发现第5天胚胎的发育速度更快、形态评分更高且妊娠率显著优于其他两组。通过RNA测序分析，鉴定出与细胞增殖、转录调控及粘附相关的差异基因，揭示了快速发育胚胎的分子机制优势，为优化胚胎移植 protocols 提供理论依据。
穆罕默德·瓦卡斯（Muhammad Waqas）| 贾伊斯尔·沙赫扎德（Qaisar Shahzad）| 阿尔穆汉·艾哈迈德·瓦杜德（Armughan Ahmad Wadood）| 塔尔哈·阿什拉夫（Talha Ashraf）| 阿里·胡斯奈因（Ali Husnain）| 穆罕默德·库拉姆·沙赫扎德（Muhammad Khurram Shahzad）| 徐慧妍（Huiyan Xu）| 普丽萍（Liping Pu）| 陆阳青（Yangqing Lu）
广西大学动物科学技术学院，中国南宁市530004
摘要
体外胚胎生产（IVEP）被广泛用作遗传改良家畜（包括牛和水牛）的工具；然而，该方法仍有很大的改进空间。观察发现，在体外培养过程中，胚胎的发育动力学存在差异；因此，识别其发育潜力及背后的生物学机制至关重要。本研究比较了授精后第5天、第6天和第7天达到囊胚阶段的胚胎的发育能力和妊娠结果。此外，还对快速发育（第5天）和缓慢发育（第7天）的胚胎进行了转录组分析。数据显示，第5天发育到囊胚阶段的胚胎比例显著高于第6天和第7天。形态学分析显示，第5天的囊胚中代码为1的胚胎比例高于第6天和第7天。胚胎染色分析表明，第5天的囊胚每个囊胚所含细胞数量显著多于第6天或第7天的囊胚。此外，第5天囊胚的妊娠率（36.5 ± 5.9%）显著高于第7天囊胚（9.8 ± 5.3%），而与第6天囊胚（20.1 ± 4.6%）相比则没有显著差异。转录组分析发现了第5天和第7天囊胚之间差异表达的基因，尤其是与细胞增殖、转录调控、增殖的正向调控以及CTNNB1介导的细胞粘附相关的基因。研究结果表明，发育更快的第5天囊胚表现出更高的粘附相关基因表达，可能增强了其着床能力。本研究为水牛胚胎移植实践中的胚胎选择提供了一种创新方法，并为优化胚胎培养方案提供了宝贵见解。
引言
水牛在欧洲、南亚和南美洲是一种重要的奶牛品种，因为它维护要求低、适应恶劣环境能力强且饲料转化效率高[1]，[2]。其重要性还在于它占全球牛奶需求的12%以上，并且脂肪和蛋白质含量高于牛奶[3]。然而，它的繁殖效率较低，表现为卵巢储备较少、产犊间隔较长以及繁殖具有季节性[4]，[5]，[6]。研究人员对其的关注不足进一步加剧了这一问题的严重性[7]。
全球人口的增长推动了动物源蛋白质需求的增加，引发了关于可持续性和粮食安全的重大关切。一个管理良好的水牛生产系统为解决这些挑战提供了潜在方案，因为奶制品和牛肉是高质量的蛋白质来源[8]，[9]。旨在提高牛肉或牛奶产量、增强对高温环境的适应性、提高生育能力以及减少代谢疾病和繁殖障碍的遗传选择是实现低投入农业和经济可持续生产系统的关键目标[10]，[11]。
IVEP是一种有效的遗传选择策略，与自然授精或人工授精方法相比，每年可以产生更多的后代。自从引入胚胎移植（ET）技术以来，水牛的遗传特性持续得到改善[12]。胚胎回收、培养系统和玻璃化技术的进步显著提高了妊娠成功率[13]。然而，无论是牛还是水牛，ET后的妊娠成功率和活产率仍然较低[14]，[15]，其中水牛的卵子质量较低、裂殖率较低、囊胚产量也较少[16]。
造成这一限制的一个因素是识别和选择最具发育能力的囊胚的挑战[17]。胚胎能力的评估通常采用主观方法，国际胚胎移植协会（IETS）的编码系统是分类囊胚阶段和质量的标准[18]。尽管该系统依赖于评估者的专业技能，但仍会导致妊娠结果不尽如人意[15]，[19]，[20]。移植前进行非整倍体检测（PGT-A）和核型检测也被用于胚胎选择，数字核型结果有助于这一过程[21]。然而，即使移植了正常核型的囊胚，人类的妊娠率也只有30-50%[22]，[23]，[24]，[59]；在牛中这一比率仅为6.5%[25]。普遍认为，要实现成功的妊娠，需要识别最具发育能力的囊胚。遗憾的是，目前没有方法能够准确预测胚胎的着床或发育能力。
关于不同发育阶段囊胚的妊娠结果，文献中存在矛盾的证据。在小鼠中，快速发育的囊胚被认为更健康，而缓慢发育的囊胚更接近体内的发育时间线[26]。早期裂殖的牛胚胎比晚期发育的胚胎更快达到囊胚阶段，但妊娠率与发育时间无关[27]。在人类中，第5天移植的囊胚比第6天移植的囊胚具有更高的临床妊娠率和活产率[28]，[29]，[30]。然而，缓慢发育的牛胚胎倾向于激活与细胞存活和凋亡相关的基因[31]。发育速度较慢的小鼠胚胎在细胞数量、胚胎体积和代谢标志物表达方面与体内来源的胚胎更为相似[26]。
推动水牛囊胚发育的分子因素正在逐步被揭示。关键基因表达水平的RNA-Seq分析为了解胚胎的细胞状态提供了预测性见解[32]，[33]，[34]。在猪中，将体外产生的2细胞和4细胞阶段的胚胎与体内发育的胚胎进行转录变化比较，以了解发育潜力降低的原因。这些研究发现，凋亡相关因子、纺锤体成分和细胞周期调节因子的转录水平发生了改变，这些因素导致了体外胚胎的发育潜力下降[35]。在猪中，裂殖更快的胚胎显示出参与减数分裂细胞周期的基因表达更高[36]，而裂殖缓慢的牛胚胎则表现出更高的caspase活性[37]。此外，体细胞核移植胚胎与体内来源的猪胚胎在基因表达谱上也存在差异[38]。然而，能够可靠预测最具发育能力的水牛囊胚的具体基因表达模式仍不清楚。
基于上述讨论，我们假设囊胚扩张的发育时间是可以可靠预测胚胎能力的指标。因此，本研究旨在通过比较第5天（快速生长）、第6天（中等生长）或第7天（缓慢生长）扩增的囊胚的发育潜力和妊娠结果来预测最具发育能力的水牛囊胚。使用SMART-Seq2技术进行了RNA-Seq分析，以识别第5天和第7天胚胎之间差异表达的基因（DEGs）。从RNA-Seq中获得的见解将有助于填补对不同发育阶段囊胚分子事件理解的空白，为囊胚移植分级提供更可靠的系统。本研究旨在辅助生殖技术中的胚胎选择提供更明智的决策依据。
材料与方法
除非另有说明，所有试剂均来自美国密苏里州圣路易斯的Sigma-Aldrich公司。实验使用的是从当地屠宰场收集和运输的水牛卵巢（包括未产犊的母牛和已产犊的母牛）。未产犊的母牛是指一生中从未产犊的雌性水牛，而已产犊的母牛则至少产犊过一次。产犊状态根据屠宰场记录和尸检结果确定。
囊胚发育潜力评估
囊胚率定义为囊胚数量与授精后卵子总数的比率。授精后第5天、第6天和第7天扩增的囊胚分别显示在图2A、2B和2C中。数据来自总共54个重复实验，共处理了12,107个卵子（n=12,107），产生了3,188个囊胚。这些囊胚根据其扩增的时间被分为第5天、第6天或第7天进行评估。
讨论
尽管已有三十多年的应用历史，尤其是在水牛领域[46]，但在辅助生殖技术（ART）中，基于早期或晚期囊胚发育来评估胚胎能力仍然存在很大争议。本研究评估了大量卵子（n = 12,107），以比较囊胚的发育速率并明确其与胚胎能力的关联，目的是识别最佳的移植候选者。
结论
总之，本研究将囊胚能力、基因表达和妊娠结果联系起来。RNA-Seq数据结合胚胎移植到代孕水牛中的结果表明，快速发育的胚胎（第5天）具有更高的质量和妊娠率。第5天囊胚中表达的DEGs共同定义了一个严格调控的分子网络，对成功的囊胚形成和着床能力至关重要。
作者贡献声明
陆阳青（Yangqing Lu）：撰写 – 审稿与编辑、监督、资源管理、方法学、概念构思。
普丽萍（Liping Pu）：撰写 – 审稿与编辑、资源管理、方法学。
徐慧妍（Huiyan Xu）：撰写 – 审稿与编辑。
贾伊斯尔·沙赫扎德（Qaisar Shahzad）：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、资源管理、方法学、概念构思。
穆罕默德·库拉姆·沙赫扎德（Muhammad Khurram Shahzad）：撰写 – 审稿与编辑、数据管理。
阿里·胡斯奈因（Ali Husnain）：撰写 –
伦理批准
本研究已获得广西大学动物实验伦理委员会的批准（GXU-2024-200）。
致谢
我们感谢Royal Cell Biotechnology Pakistan, Co. (Private) Limited提供的实验材料支持。
