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SIRT1通过NSUN2/YBX1介导的m5C甲基化调控人类腱源性干细胞损伤修复机制研究。
作者：朱波|刘绍丽|顾浩|丁东梅|曲东晶|刘景天
单位：中国云南省曲靖市中心医院关节与运动医学科，邮编655000
摘要
背景
肌腱来源的干细胞（TDSCs）在肌腱再生中起着关键作用。研究表明，sirtuin 1（SIRT1）可能参与调节肌腱修复过程。然而，SIRT1是否通过影响TDSCs来促进肌腱修复尚不清楚，这正是我们研究的重点。
方法
人类肌腱来源的干细胞被过氧化氢（H2O2）处理以诱导细胞损伤。采用定量实时PCR和Western blotting技术检测mRNA和蛋白质的水平。分析了细胞增殖、凋亡和炎症反应。通过活性氧（ROS）、丙二醛和超氧化物歧化酶的水平来评估氧化损伤。甲基化RNA免疫沉淀实验确认了NOP2/Sun结构域家族成员2（NSUN2）和Y-box结合蛋白1（YBX1）在SIRT1的5-甲基胞嘧啶（m5C）位点上的结合情况。RNA-蛋白质结合通过RIP和RNA pull-down实验进行检测。
结果
SIRT1能够逆转H2O2诱导的细胞凋亡、IL-6和IL-1β水平的升高以及氧化损伤，并抑制人类TDSCs的成肌分化。进一步机制分析表明，SIRT1具有m5C位点，NSUN2可诱导SIRT1的m5C修饰，并以YBX1依赖的方式稳定SIRT1的表达。此外，NSUN2能够抑制H2O2诱导的细胞凋亡、炎症和氧化损伤，同时这些效应可被SIRT1沉默所逆转。
结论
NSUN2介导的m5C甲基化导致SIRT1表达上调，从而抑制细胞凋亡、炎症和氧化应激，促进人类TDSCs的成肌分化。
引言
肌腱损伤是一个常见的临床问题，给全球带来了沉重的社会经济负担（Liu等人，2022年）。由于肌腱本身细胞密度低且血管较少，其修复过程为缓慢的纤维化愈合，常常导致恢复不完全并形成瘢痕组织，甚至可能再次断裂（Nichols等人，2019年；Whalen，1951年）。肌腱损伤占所有肌肉骨骼疾病的30%，并且随着体力活动的增加和人口老龄化，这一比例还在上升（Andarawis-Puri等人，2015年）。这种发病率的上升加剧了人们对肌腱来源干细胞/前体细胞（TDSCs）的关注。TDSCs是一种稀少但具有克隆能力的亚群，最近的研究表明它们能够调控胶原纤维的形成和机械适应性（Chen等人，2013年）。TDSCs具有独特的成肌分化能力，是维持肌腱结构和功能的基本细胞（He等人，2024年；Tempfer和Traweger，2025年）。阐明TDSC的命运如何受到重复性负荷或炎症细胞因子的影响，有望开发出超越现有姑息性治疗的再生策略。
肌腱修复过程通常包括早期炎症阶段，随后是增殖和重塑阶段（Xu等人，2024年）。TDSCs具有向软骨细胞、成骨细胞、脂肪细胞和肌腱分化的潜力（Jiang等人，2023年）。肌腱损伤后活化的TDSCs会迁移到损伤部位，通过增殖和分化替代受损或丢失的细胞，在再生过程中起关键作用（Huang等人，2021年）。TDSCs可以平衡细胞外基质（ECM）的合成和免疫调节，但其活性会被创伤后释放的促炎细胞因子抑制（Wang等人，2022年；Chen等人，2024年）。持续的炎症会使TDSC的命运偏向于纤维化而非有序增殖，从而导致机械性能较弱的瘢痕组织（Lui和Chan，2011年）。此外，肌腱损伤还会产生过多的活性氧（ROS），超过肌腱的抗氧化能力，进而引发炎症和进一步的肌腱损伤（Lui等人，2024年）。sirtuin 1（SIRT1）是一种高度保守的NAD+-依赖的去乙酰化酶，作为翻译后调节因子在炎症调节中起重要作用（Yang等人，2022年）。SIRT1还可以通过去乙酰化组蛋白和非组蛋白蛋白来调节多种生物过程，如衰老、免疫反应、炎症和氧化应激（Lu等人，2024年）。Chen等人还发现，壳聚糖在兔屈肌腱修复过程中通过提高SIRT1表达，防止了白细胞介素（IL）-1β诱导的肌腱细胞凋亡和黏附（Chen等人，2015年）。Liu的团队研究表明，SIRT1可以诱导TDSCs的成骨分化并抑制其成脂分化（Liu等人，2016年）。SIRT1信号通路还介导骨髓间充质干细胞的BMP14诱导的成肌分化（Wang等人，2018年）。这些结果表明SIRT1可能在肌腱修复中发挥作用。
目前越来越多的证据表明，表观遗传调控在各种疾病的发病和进展中起着重要作用（Cao等人，2024年；Zhang等人，2020年）。其中，RNA转录后修饰，如5-甲基胞嘧啶（m5C），已成为疾病研究中的关键机制（Wang等人，2023年；Lin等人，2024年）。通过生物信息学分析，本研究表明SIRT1具有m5C位点。RNA m5C甲基化是一个动态且可逆的过程，主要由m5C甲基转移酶、去甲基酶和m5C甲基化结合蛋白调控（Song等人，2022年）。NOP2/Sun RNA甲基转移酶2（NSUN2）是一种重要的核仁RNA甲基转移酶，可催化mRNA中的m5C形成；此外，Y-box结合蛋白1（YBX1）这种胞质中的mRNA m5C读取蛋白可以在m5C甲基化过程中直接结合m5C修饰的mRNA（Wang等人，2023年）。先前的一项研究表明，来自间充质干细胞的NSUN2通过提高dynamin 2（DNM2）的表达，以YBX1依赖的方式改善了肌腱损伤（Liu等人，2026年）。因此，我们推测SIRT1在肌腱修复中的潜在作用可能与NSUN2/YBX1介导的m5C修饰有关。
本研究旨在探讨SIRT1在过氧化氢（H2O2）处理下对TDSCs的炎症、增殖和氧化应激的影响，这可能为开发新的肌腱损伤治疗策略提供细胞和分子基础。
细胞培养
人类肌腱来源的干细胞（TDSCs）来自中国科学院细胞库（上海），并在含有10%加热灭活的胎牛血清（FBS）、100 mg/mL链霉素和100 U/mL青霉素（均来自美国加利福尼亚州卡尔斯巴德的Invitrogen公司）的低糖Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中培养，培养条件为37℃和5% CO2。使用第3或4代的TDSCs进行后续分析。为了建立TDSC损伤模型，将TDSCs用200 μM H2O2处理。
SIRT1过表达可逆转H2O2诱导的人类TDSCs细胞凋亡和炎症
为了研究SIRT1在H2O2诱导的TDSC损伤中的作用，将OE-SIRT1转染到TDSCs细胞中，使SIRT1过表达。Western blotting结果显示，OE-SIRT1转染显著提高了H2O2诱导的TDSCs中的SIRT1表达（图1A）。功能实验表明，SIRT1过表达逆转了H2O2诱导的TDSC抑制作用（图1B，C），这一点通过MTT和EdU检测得到证实。此外，H2O2会导致TDSC细胞凋亡，而SIRT1过表达可以消除这种效应（图1D）。
NSUN2诱导SIRT1的m5C修饰
RMVar2.0和RNAm5Cfinder数据库预测SIRT1具有m5C位点（图3A）。为了研究负责整个转录组mRNA m5C形成的甲基转移酶，抑制了TDSCs中的NSUN家族成员（NSUN1/2/3/4/5/6）。如图S1A-F所示，si-NSUN1/2/3/4/5/6的干扰效率通过Western blotting得到验证。结果发现，只有抑制NSUN2会导致SIRT1表达下调（图S1G）。因此，NSUN2可能...
讨论
与其他干细胞一样，TDSCs也具有克隆性、自我更新能力和多向分化能力。已有研究表明，TDSCs在体内植入后可以生长并再生为类似肌腱的组织（Zhang等人，2019年）。不幸的是，肌腱在受到创伤时会产生ROS，这不可避免地会导致TDSCs的氧化损伤（Li等人，2021年；Lui等人，2022年）。因此，本研究使用H2O2来损伤TDSCs。
伦理批准和参与同意
不适用。
资助
无
CRediT作者贡献声明
刘绍丽：项目管理、方法学、实验设计、数据分析。
朱波：初稿撰写、验证、项目管理、方法学、数据分析、概念构思。
刘景天：审稿与编辑、监督、软件使用、方法学、数据分析。
曲东晶：数据验证、资源协调、数据分析。
丁东梅：数据验证、监督、资源协调。
顾浩：软件使用、资源提供、方法学、数据分析。
致谢
无
出版同意
不适用。
利益冲突
作者没有需要披露的利益冲突。
作者贡献
朱波构思并设计了本研究，并起草了初稿。所有实验均由所有作者完成。刘绍丽、顾浩、丁东梅、曲东晶、刘景天分析了结果并整理了数据。所有作者都审阅并批评了手稿，并同意最终提交。所有作者都阅读并批准了最终版本的手稿。
