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骨质疏松的雌激素替代疗法存在副作用风险，需探索植物雌激素替代方案。本研究通过卵巢切除大鼠及体外成骨细胞实验，比较了Vitex agnus-castus（VAC）与β-雌二醇的骨保护效果。结果显示：VAC（200 mg/kg）虽能部分改善骨微结构，但无法完全恢复骨体积（较卵巢切除组减少60%）；β-雌二醇（20 μg/kg）显著维持骨密度和微架构。体外实验表明：VAC（1 μg/mL）可部分缓解H2O2诱导的氧化应激，上调Alp、Runx2等骨形成相关基因表达，但矿化程度和碱性磷酸酶活性仍低于雌激素组。结论指出VAC单独应用不足以替代雌激素，需优化剂量或联合其他策略。
玛丽亚·卡罗莱纳·科埃略（Maria Carolina Coelho）|路易斯·加布里埃尔·普拉齐尔·格德斯·德梅洛（Luiz Gabriel Plasier Guedes de Mello）|亚斯明·塔瓦雷斯·卡马戈（Yasmin Tavares Camargo）|罗杰·罗德里戈·费尔南德斯（Roger Rodrigo Fernandes）|萨尤里·波利·苏吉莫托（Sayuri Poli Suguimoto）|罗伯塔·奥卡莫托（Roberta Okamoto）|塞尔玛·西塞雷（Selma Siessere）|卡琳娜·菲蒂帕尔迪·邦博纳托-普拉多（Karina Fittipaldi Bombonato-Prado）
巴西圣保罗大学里贝朗普雷图分校牙科学院基础与口腔生物学系骨骼研究实验室
摘要
在雌激素缺乏导致的骨质疏松症中，氧化应激起着致病作用，并成为预防骨质流失策略的目标。目前的治疗方法可能会产生副作用，这促使人们寻找替代方案，包括像Vitex agnus-castus（VAC）这样的植物雌激素，其结构与内源性雌激素相似。然而，VAC单独使用是否足以在雌激素缺乏的情况下发挥骨保护作用仍不清楚。本研究评估了VAC与雌激素替代疗法在卵巢切除大鼠及暴露于氧化应激的成骨细胞中的效果。卵巢切除后，给大鼠注射VAC（200 mg/kg）和β-雌二醇（20 μg/kg），持续12周，然后通过组织形态学和微计算机断层扫描分析股骨和下颌骨。将骨髓来源的间充质细胞和MC3T3-E1细胞与VAC（1 μg/mL）或β-雌二醇（10–8 mol/L）共同培养，并暴露于400 μmol/L的过氧化氢中。研究评估了碱性磷酸酶（ALP）的检测结果、矿化程度及基因表达情况。卵巢切除会损害骨微结构，使股骨体积减少多达60%，而雌二醇可以保持小梁结构，VAC仅显示出有限的保护作用。微CT显示卵巢切除后股骨的小梁数量减少且小梁间距增大，这一现象可被雌二醇阻止，但VAC无法实现。
氧化应激会降低ALP的检测水平和矿化程度。雌二醇可改善矿化情况，而VAC在氧化应激条件下部分恢复了ALP的沉积，并上调了Alp、Runx2、Bsp和Sod3的表达。
这些发现表明，尽管VAC能够调节成骨和抗氧化途径，但其单独使用不足以替代雌激素治疗，因此需要优化剂量和联合使用策略。
引言
骨质疏松症是一种以骨稳态失衡为特征的疾病，表现为矿化基质沉积减少和骨吸收增加，从而增加骨折风险，尤其是在绝经后女性中。这一时期，雌激素缺乏会导致骨密度降低、骨微结构恶化以及骨折抵抗力下降（Walker & Shane, 2023）。除了激素变化外，骨质疏松症还与氧化应激有关，其特征是自由基（包括活性氧物种ROS和活性氮物种RNS）的增多。在骨细胞中，过量的ROS通过激活MAPK和NF-κB信号通路直接刺激破骨细胞的分化和活性，从而增加骨吸收（Iantomasi et al., 2023）。同时，ROS通过诱导细胞凋亡、抑制成骨基因表达以及破坏线粒体功能来损害成骨细胞的分化和功能，从而减少骨形成（Zhang et al., 2023）。ROS还会促进骨细胞凋亡和衰老，进而损害骨微结构和强度（Marcucci et al., 2023）。抗氧化防御系统，尤其是Nrf2通路，对于对抗ROS至关重要，其功能障碍会加剧氧化损伤和骨质流失（Gu et al., 2025）。骨质疏松症的全球负担很重，预计到2050年由于老龄化，每年髋部骨折的数量将几乎翻倍（Sing et al., 2023, Morin et al., 2025）。诊断包括评估骨密度、骨折风险以及考虑次要风险因素，如饮酒习惯、吸烟习惯、缺乏运动和饮食模式（Arceo-Mendoza & Camacho, 2021）。现有证据支持将双膦酸盐和狄诺单抗作为高骨折风险患者的一线治疗药物（Morin et al., 2025），而对于极高骨折风险的患者，则使用重组人PTH（teriparatide）、阿巴帕拉肽（abaloparatide）或罗莫索珠单抗（romosozumab），通常还需配合抗吸收药物（Walker & Shane, 2023）。尽管有这些治疗选择，某些患者可能从绝经激素疗法（MHT）中受益，尤其是60岁以下或绝经后10年内的女性（Eastell et al., 2019）。MHT通过抑制骨吸收和促进成骨细胞存活来调节骨稳态。雌激素可增加成骨细胞产生的骨保护素（OPG），抑制促炎细胞因子（IL-1、IL-6、TNF-α），限制破骨细胞的生成，并激活Wnt信号通路以增强成骨细胞分化和骨形成（Hsu et al., 2024）。然而，使用MHT会增加患乳腺癌和心血管疾病的风险。选择性雌激素受体调节剂（SERMs）已被开发出来，它们针对这些受体并减少这些副作用，尽管可能会增加血栓栓塞疾病和中风的风险（Jelin-Uhlig et al., 2024）。这些安全问题凸显了需要寻找既能支持骨骼健康又能最小化全身风险的替代疗法。因此，能够模拟雌激素骨保护作用的植物雌激素引起了越来越多的关注。在骨骼中，植物雌激素已被证明可以促进成骨细胞分化、抑制破骨细胞生成，并调节RANKL/OPG轴，从而增强骨形成和减少骨吸收（Khan et al., 2025, Perrone et al., 2025）。临床前和临床研究表明，定期摄入植物雌激素（尤其是来自大豆和红三叶草的雌激素）可以改善绝经后女性的骨密度和骨转换标志物，且不良反应较少（Intharuksa et al., 2025）。基于这些发现，Vitex agnus-castus（VAC，俗称贞洁树）受到了特别关注，这种植物富含植物雌激素，对雌激素受体β（ERβ）具有选择性活性，常用于经前综合征的管理（Csupor et al., 2019, Mollazadeh et al., 2019）。VAC中的植物雌激素通过特定的黄酮类化合物（尤其是芹菜素）对ERβ具有选择性活性，芹菜素优先结合ERβ而非雌激素受体α（ERα）（Jarry et al., 2003）。雌激素受体β在成骨细胞、破骨细胞和骨细胞中表达，通过调节基因转录来参与骨重塑（Khalid and Krum, 2016）。此外，体外实验表明，VAC的抗氧化作用归因于其中丰富的酚类化合物、黄酮类和萜类化合物，显示出显著的自由基清除能力（Bramki et al., 2025）。基于此，我们假设VAC单独使用可能在雌激素缺乏条件下对骨重塑产生可测量的调节作用，优于雌激素治疗。
动物伦理
所有动物实验均遵循ARRIVE指南以及美国国立卫生研究院（NIH）发布的《实验动物护理和使用指南》（NIH Publication No. 85–23，1996年修订版），并得到了圣保罗大学里贝朗普雷图分校动物护理委员会的批准（伦理协议0024/2021-R1）。
骨质疏松症的诱导
54只雌性Sprague-Dawley大鼠被分为3组：卵巢切除组（OVX）和3组假手术组（SHAM），每组9只。实验前对大鼠进行称重，并使用xylazine（10 mg/kg）麻醉。
骨形态和组织形态学分析
图1显示了H&E染色的股骨切片组织学分析结果，OVX组与SHAM组之间存在明显差异。SHAM组保持了正常的小梁结构，小梁较粗，骨细胞丰富，骨髓脂肪含量低。OVX组表现出典型的骨质疏松症特征，小梁变细，骨细胞减少，脂肪细胞浸润明显。雌激素治疗保持了小梁结构并减少了脂肪含量，使其形态与SHAM组相似。
植物雌激素是非甾体多酚类植物化合物，其结构与内源性雌激素（特别是17β-雌二醇）相似，因此能够结合雌激素受体（ERα和ERβ），根据生理环境的不同表现出雌激素样或抗雌激素样作用（Patra et al., 2023）。它们的生物活性取决于其对雌激素受体的亲和力及其在不同植物来源中的浓度。植物雌激素被分为几个主要化学类别（Cos et al., 2003; Swathi Krishna et al., 2022）：异黄酮类
结论
据我们所知，这是首批直接比较VAC单独使用与雌激素替代疗法在雌激素缺乏和氧化应激共同作用下的研究的之一。我们的研究结果表明，Vitex agnus-castus（VAC）对卵巢切除的雌性大鼠具有部分骨保护作用，但未能完全复制雌二醇的骨保护效果。未来的研究应重点关注优化剂量策略和活性植物化学物质的全面表征。
作者贡献声明
卡琳娜·菲蒂帕尔迪·邦博纳托-普拉多（Karina Fittipaldi Bombonato-Prado）：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、数据验证、研究设计、资金获取、数据分析、概念构思。塞尔玛·西塞雷（Selma Siessere）：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、数据分析、概念构思。路易斯·加布里埃尔·普拉齐尔·格德斯·德梅洛（Luiz Gabriel Plasier Guedes de Mello）：方法学设计、研究实施。玛丽亚·卡罗莱纳·科埃略（Maria Carolina Coelho）：初稿撰写、数据验证、方法学设计、研究实施、概念构思。罗伯塔·奥卡莫托（Roberta Okamoto）：撰写 –
伦理批准声明
所有动物实验均遵循ARRIVE指南以及美国国立卫生研究院发布的《实验动物护理和使用指南》（NIH Publication No. 85–23，1996年修订版），并得到了圣保罗大学动物使用伦理委员会（CEUA）的批准（伦理协议0024/2021-R1）。
资金支持
本研究由巴西圣保罗研究基金会（FAPESP，项目编号2021/14976–6和2021/08029–4）以及巴西国家科学技术研究院转化医学部门资助。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
作者感谢技术员Luiz Gustavo de Sousa在卵巢切除手术中的协助，以及Dimitrius Leonardo Pitol在组织学实验方案方面的支持。
